王曉亞 高樂 范帥帥 王鑫國 李軍山 牛麗穎

摘要：目的 ?制備山萸肉飲片標準湯劑并進行質量研究，為相關研究與藥物開發(fā)提供參考。方法 ?根據(jù)中藥飲片標準湯劑制備原則，制備15批不同產(chǎn)地的山萸肉飲片標準湯劑，以莫諾苷、馬錢苷和山茱萸新苷作為定量檢測指標，計算轉移率與出膏率，并建立超高液相色譜（UPLC）特征圖譜分析方法。結果 ?15批山萸肉飲片標準湯劑的出膏率為43.9%～48.2%，莫諾苷轉移率為55.8%～90.8%，馬錢苷轉移率為52.8%～68.3%，山茱萸新苷轉移率為47.2%～61.6%。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件進行特征圖譜分析，標定了13個共有峰，對15批山萸肉飲片及標準湯劑進行相似度評價，其相似度均大于0.9。結論 ?本研究山萸肉飲片標準湯劑制備規(guī)范，測定方法準確可靠，能夠反映山萸肉水煎制劑的內在質量，可為山萸肉配方顆粒的質量控制提供參考。

關鍵詞：山萸肉;飲片;標準湯劑;配方顆粒;轉移率;出膏率;特征圖譜

中圖分類號：R284.1 ???文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）02-0074-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.016

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Abstract： Objective To prepare Corni Fructus standard decoction and conduct research on quality; To provide references for research and development of related medicine. Methods Fifteen batches of Corni Fructus standard decoction were prepared according to the standardization method of TCM decoction pieces. With morroniside， loganin and cornuside as the detection indices， the transfer rate and extraction rate were calculated， and the UPLC characteristic chromatograms analysis method was established. Results According to the measurement of 15 batches of Corni Fructus standard decoctions， the extractum rate was at the range of 43.9%–48.2%， and the transfer rates of morroniside， loganin and cornuside were 55.8%–90.8%， 52.8%–68.3% and 47.2%–61.6%， respectively. Besides， Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012 edition） was used to analyze and compare the characteristic chromatograms， and 13 common peaks were determined. The similarity was over 0.9. Conclusion The preparation of Corni Fructus standard decoction is standard. The determination method is reliable and accurate， which can be used to reflect the quality of Corni Fructus standard decoctions and provide references for the quality control of Corni Fructus formula granules.

Keywords： Corni Fructus; decoction pieces; standard decoction; formula granules; transfer rate; extractum rate; characteristic chromatogram

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，除去雜質和殘留果核即為山萸肉，味酸、澀，性微溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補益肝腎、收澀固脫功效，用于眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫、內熱消渴^[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，山萸肉化學成分主要為環(huán)烯醚萜、鞣質、揮發(fā)油、黃酮類和有機酸等^[2-4]，具有抗炎抑菌、抗心律失常、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗血栓、降血糖、降血脂等藥理作用^[4-7]。

隨著制劑工藝的發(fā)展，中藥配方顆粒的應用日趨廣泛，解決了傳統(tǒng)湯劑制備和使用不便等問題，具有免煎易服、作用迅速、攜帶方便、安全衛(wèi)生等優(yōu)點^[8-9]，但目前配方顆粒仍存在一些問題，如標準不明確、劑量不統(tǒng)一、臨床合理性有待進一步論證等^[10-11]。為解決中藥配方顆粒發(fā)展面臨的問題，國家藥典委員會于2016年發(fā)布了《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求（征求意見稿）》，提出標準湯劑的概念，將其作為評價中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的標準參照物。中藥飲片標準湯劑是指以中醫(yī)藥理論為指導，選取道地藥材或主產(chǎn)區(qū)藥材，經(jīng)加工炮制成合格飲片后，參考現(xiàn)代提取方法，經(jīng)標準化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑^[12]。中藥配方顆粒的生產(chǎn)工藝參數(shù)確定、質量控制方法和指標選擇、限度制定等藥學研究均須與標準湯劑進行對比，以保證與臨床湯劑的質量一致性。本研究依據(jù)中藥飲片標準湯劑制備要求，選用主產(chǎn)區(qū)符合2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)范的15批山萸肉飲片制備標準湯劑，以莫諾苷、馬錢苷和山茱萸新苷為指標成分，計算轉移率和出膏率范圍，并進行特征圖譜研究，為山萸肉飲片標準湯劑質量標準的制定提供依據(jù)，并為山萸肉配方顆粒的質量控制和評價提供參考。

1? 儀器與試藥

ACQUITY UPLC H-Class系統(tǒng)（PDA檢測器），美國沃特世公司;Empower3色譜工作站，美國沃特世公司;LC-15C高效液相色譜儀（SPD-15C型紫外檢測器、SIL-10AF自動進樣器、CTO-15C柱溫箱），日本島津公司;Pilot5-8L真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;TB-215D、BSA224S-CW電子分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司;JY10001型電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司;RE-3000型旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;KQ-250型超聲波清洗器（功率250 W，頻率40 kHz），昆山市超聲儀器有限公司;BJH-W200F型陶瓷自動中藥煲（電源220 V、50 Hz，功率300 W，容量3.0 L），廣東天際電器股份有限公司;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司。

莫諾苷對照品（批號151215，純度≥98%）、馬錢苷對照品（批號15110202，純度≥98%）、山茱萸新苷對照品（批號151120，純度≥98%），成都普菲德有限公司;乙腈（Fisher化學試劑公司）、磷酸為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。15批山萸肉飲片均由神威藥業(yè)集團有限公司提供，經(jīng)河北省藥品檢驗研究院孫寶惠鑒定為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，樣品來源見表1。

2? 方法與結果

2.1? 標準湯劑的制備

稱取山萸肉飲片100.0 g，煎煮2次。一煎加水800 mL，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸30 min，100目篩網(wǎng)趁熱過濾;二煎加水600 mL，武火煮沸，文火保持微沸20 min，100目篩網(wǎng)趁熱過濾，合并2次煎液，迅速冷卻，50 ℃真空減壓濃縮至密度為1.03～1.10，使用密度計和pH計測定流浸膏的密度和pH值，放入冰柜冷凍（-40 ℃）過夜，用冷凍干燥機干燥，即得標準湯劑干燥粉末。按2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則0800水分測定法第二法（烘干法）測定水分。取山萸肉干粉，每批約1 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過5 mm，精密稱定，開啟瓶蓋，于100～105 ℃干燥5 h，將瓶蓋蓋好，轉移至干燥器中，冷卻30 min，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，放冷，稱重，至連續(xù)2次稱重差異不超過5 mg為止，根據(jù)減失的質量計算干膏粉水分含量。根據(jù)公式[出膏率（%）=凍干粉質量÷飲片質量×100%]計算出膏率，結果平均出膏率為（46.09±2.78）%。15批山萸肉飲片標準湯劑密度、pH值、水分、出膏率測定結果見表2。

2.2? 莫諾苷、馬錢苷和山茱萸新苷含量測定

2.2.1? 色譜條件

色譜柱：WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）;以0.3%磷酸為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫（0～11 min，7%B;11～15 min，7%→11%B;15～30 min，11%→25%B;30～40 min，25%B;40～40.01 min，25%→7%B;40.01～50 min，7%B）;流速：1.0 mL/min;檢測波長：240 nm，柱溫：30 ℃。

2.2.2? 對照品溶液的制備

精密稱取莫諾苷、馬錢苷和山茱萸新苷對照品適量，加80%甲醇配制成每1 mL含66.6 ?g莫諾苷、34.9 ?g馬錢苷和9.0 ?g山茱萸新苷的對照品溶液，即得。

2.2.3? 供試品溶液的制備

取干膏粉適量，研細，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）20 min，放冷，再稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，即得山萸肉標準湯劑供試品溶液;取15批飲片粉末約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）20 min，放冷，再稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，即得山萸肉飲片供試品溶液。

2.2.4? 方法學考察

2.2.4.1? 線性關系考察

精密吸取對照品溶液2、4、8、12、16、20 ?L，按上述色譜條件測定。以莫諾苷進樣量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，結果表明莫諾苷在0.133 1～1.331 2 ?g范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=1.588 2×10⁶X-1.153 1×10⁴，r=0.999 6;以馬錢苷進樣量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，結果表明馬錢苷在0.069 7～0.697 2 ?g范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=1.279 0×10⁶X-4.751 3×10³，r=0.999 6;以山茱萸新苷進樣量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，結果表明山茱萸新苷在0.018 0～0.180 0 ?g范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=1.152 6×10⁶X-5.391 2×10²，r=0.999 6。

2.2.4.2? 精密度試驗

精密吸取對照品溶液10 ?L，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，計算得莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷峰面積RSD分別為0.76%、0.81%、0.68%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3? 穩(wěn)定性試驗

精密稱取干膏粉約0.1 g，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液5 ?L，按上述色譜條件分別于0、2、4、8、12、18、24 h進樣測定，計算得莫諾苷、馬錢苷和山茱萸新苷峰面積RSD分別為0.52%、0.62%、0.75%，結果表明，供試品溶液中莫諾苷、馬錢苷和山茱萸新苷在24 h內穩(wěn)定。

2.2.4.4? 重復性考察

精密稱取干膏粉6份，每份約0.1 g，按“2.2.3”項下方法制備，精密吸取供試品溶液5 ?L，按上述色譜條件進樣，計算得供試品溶液莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷含量RSD分別為0.96%、1.21%、0.72%，表明本法重復性較好。

2.2.4.5? 準確度考察

采用加樣回收法，取同一批干膏粉6份，每份約0.025 g，精密稱定，精密加入一定體積的莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷對照品貯備液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，每份樣品平行測定2次，結果莫諾苷、馬錢苷和山茱萸新苷的平均回收率分別為97.75%、102.32%、99.53%，表明本法準確度良好。

2.2.5? 樣品含量測定

按上述色譜條件測定15批山萸肉飲片和標準湯劑中莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷的含量，計算轉移率。結果見表3。

2.3? 特征圖譜的建立與分析

2.3.1? 色譜條件

采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m）;以0.2%磷酸為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫（0～4 min，6%→10%B;4～6 min，10%B;6～15 min，10%→25%B;15～16 min，25%→70%B;16～18 min，70%B;18～19 min，70%→6%B;19～25 min，6%B）;流速：0.3 mL/min;檢測波長：240 nm;柱溫：35 ℃;進樣量：1 ?L。

2.3.2? 對照品溶液制備

精密稱取莫諾苷、馬錢苷和山茱萸新苷對照品適量，加80%甲醇配制成每1 mL含66.6 ?g莫諾苷、34.9 ?g馬錢苷和9.0 ?g山茱萸新苷的對照品溶液，即得。選擇莫諾苷峰作為參照峰。

2.3.3? 供試品溶液的制備

取干膏粉約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）20 min，放冷，再稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，即得。

2.3.4? 方法學考察

2.3.4.1? 精密度試驗

精密吸取同一份供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.2? 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一份供試品溶液，分別于制備0、1、2、4、8、12 h進樣，記錄各峰的峰面積，計算得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.4.3? 重復性試驗

精密稱取同一批干膏粉（1609062）樣品6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液1 ?L，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析并記錄各峰的峰面積，計算得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.3.5? 特征圖譜的建立

分別制備15批山萸肉飲片、標準湯劑的供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄16 min色譜圖，將所得數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件，采用多點校正將譜峰自動匹配，平均數(shù)法計算得出樣品特征圖譜的共有模式，結果。其中，確定了15批山萸肉標準湯劑中13個共有峰，并指認了峰4為莫諾苷，峰9為馬錢苷，峰13為山茱萸新苷。

2.3.6? 相似度分析

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》計算特征圖譜相似度，結果見表4。15批山茱萸飲片特征圖譜的相似度均大于0.96，15批山萸肉標準湯劑特征圖譜的相似度均大于0.97，表明15批山萸肉標準湯劑有良好的相似性。比較山萸肉飲片、標準湯劑的特征圖譜，對共有峰進行分析可知，山萸肉標準湯劑13個特征峰在飲片中均能得到追蹤，表明山萸肉標準湯劑與飲片化學成分基本一致。

3? 討論

湯劑是應用最廣泛的中藥劑型。隨著劑型現(xiàn)代化的發(fā)展，中藥出現(xiàn)了配方顆粒、破壁飲片等劑型。目前不同劑型之間存在標準不明確、劑量不統(tǒng)一、質量不均一等問題，陳士林等^[12]提出采用中藥飲片標準湯劑標化不同用藥形式，以提高臨床用藥的準確性和療效的一致性。本研究以中醫(yī)理論為指導，參照國家藥典委員會2016年發(fā)布的《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求（征求意見稿）》和原衛(wèi)生部、國家中醫(yī)藥管理局2009年印發(fā)的《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》，利用現(xiàn)代提取設備，采用經(jīng)標準化工藝制備的山萸肉飲片，以水為提取溶劑，通過物理方法固液分離、低溫減壓濃縮、冷凍干燥，制得山萸肉飲片標準湯劑。為避免因取樣較少引起的誤差，并為工業(yè)生產(chǎn)提供參考，制備標準湯劑的飲片用量定為100 g;山萸肉為果肉入藥，無特殊煎煮要求，故一煎加8倍水，煎煮30 min，二煎加6倍水，煎煮20 min;試驗中采用趁熱濾過方式進行固液分離，減少成分的損失;趁熱濾過后迅速冷卻，以減少成分的熱分解，同時采用低溫減壓濃縮、冷凍干燥方法以保證煎液質量的穩(wěn)定性，最大限度達到與傳統(tǒng)湯劑一致的目的。

山萸肉的有效成分在標準湯劑干膏粉制備過程中已被煮提出來，故制備供試品溶液時采用超聲溶解即可。本試驗對提取溶劑的種類和提取時間進行了考察。分別以60%、80%、100%甲醇作為提取溶劑，結果以80%甲醇提取較完全，故選用80%甲醇作為提取溶劑;選擇10、20、30 min進行提取時間考察，結果超聲20 min效果最好，故選擇20 min進行超聲提取。

莫諾苷、馬錢苷和山茱萸新苷均為環(huán)烯醚萜苷類成分，易溶于水、甲醇，標準湯劑以水為提取溶媒，所以，在山萸肉標準湯劑制備過程中3種成分均具有較高的轉移率。

本試驗基于HPLC和UPLC建立了山萸肉飲片標準湯劑的含量測定方法及特征圖譜分析方法，方法學考察均符合要求，表明本方法穩(wěn)定可行、重現(xiàn)性良好，含量測定結合特征圖譜能夠較全面地反映山萸肉水煎制劑的內在質量，可為山萸肉配方顆粒的質量控制和評價提供參考。

山萸肉標準湯劑與飲片特征圖譜的主要色譜峰基本一致，其對照特征圖譜的相似度達0.99以上，表明山萸肉標準湯劑與飲片主要化學成分基本相同，可為山萸肉配方顆粒替代傳統(tǒng)飲片的可行性研究提供參考。

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