楊小璇，吳畏

存在兩種或兩種以上不同核型細(xì)胞系的胚胎被稱為嵌合胚胎。根據(jù)其起源，嵌合體有由單個受精卵發(fā)育而來（mosaicism）與非單個受精卵發(fā)育而來（chimerism）之分。人類輔助生殖技術(shù)中，對于有必要行遺傳學(xué)診斷的患者，一般選擇胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）的體外受精方式，以最大限度減少母源顆粒細(xì)胞和父源精子對下游遺傳學(xué)檢測準(zhǔn)確性的干擾。因此，這里只討論由單個受精卵發(fā)育而來的嵌合胚胎。非整倍體胚胎的形成，是由于減數(shù)分裂形成配子的過程發(fā)生錯誤；嵌合是有絲分裂過程中，部分細(xì)胞染色體分離異常，導(dǎo)致染色體增加或丟失，成為非二倍體細(xì)胞，其發(fā)生機(jī)制本質(zhì)上都是有絲分裂錯誤的發(fā)生機(jī)制，并非嵌合型所獨(dú)有。這些有絲分裂錯誤發(fā)生的原因尚不清楚。隨著新的遺傳技術(shù)平臺的發(fā)展，對移植前胚胎倍性狀態(tài)的診斷不再局限于整倍體或非整倍體，而是通過量化異常細(xì)胞比例進(jìn)行分類[1]。國際植入前遺傳學(xué)診斷協(xié)會（the Preimplantation Genetic Diagnosis International Society，PGDIS）將嵌合比例＜20%的胚胎視為整倍體，＞80%視為非整倍體，20%～80%視為嵌合體，以此指導(dǎo)胚胎檢測結(jié)果的判定。

1 嵌合胚胎的分類

按嵌合的分布，嵌合胚胎可分為兩種：第一種為廣泛嵌合，指胚胎的胎盤和胎體均出現(xiàn)嵌合，分裂錯誤發(fā)生較早，導(dǎo)致嵌合細(xì)胞系存在于整個胚胎；第二種為局限性嵌合，指染色體嵌合局限在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的部分或全部細(xì)胞，或者滋養(yǎng)外胚層的部分或全部細(xì)胞[2]。此種類型發(fā)生率更高，有出現(xiàn)在腦部、性腺、胎盤等部位的報道[3]。當(dāng)有絲分裂錯誤發(fā)生在胚胎細(xì)胞已分化的階段，如出現(xiàn)在滋養(yǎng)層，分化后就只有胎盤嵌合，胎兒可為整倍體，從而形成局限性胎盤嵌合（confined placental mosaicism，CPM）。CPM與胎兒生長受限、自發(fā)性流產(chǎn)、死胎及胎盤功能異常等有關(guān)。

按染色體組成，嵌合胚胎可分成3種：第1種為非整倍體嵌合，是不同非整倍體細(xì)胞的混合（即胚胎中沒有二倍體細(xì)胞），在卵裂期胚中約占15%[4]。有絲分裂錯誤發(fā)生在已經(jīng)出現(xiàn)減數(shù)分裂錯誤的胚胎，或有絲分裂錯誤發(fā)生在第一次卵裂，從而產(chǎn)生了兩種不同類型的非整倍體子細(xì)胞而形成。第2種為二倍體-非整倍體嵌合，指胚胎中既有非整倍體細(xì)胞，又有二倍體細(xì)胞，在卵裂期胚胎中約占50%[4]。通常由于二倍體受精卵的子代細(xì)胞發(fā)生有絲分裂錯誤而產(chǎn)生。罕見情況中，非整倍體細(xì)胞自我補(bǔ)救產(chǎn)生的二倍體子代也可導(dǎo)致該種嵌合類型[5]。倍性嵌合也稱為混倍體胚胎，是不同倍數(shù)細(xì)胞的混合。早期植入前遺傳學(xué)篩查（preimplantation genetic screening，PGS）研究使用熒光原位雜交（FISH）技術(shù)發(fā)現(xiàn)了卵裂期二倍體-四倍體嵌合的高發(fā)生率（15%）[6]。第3種為雜亂嵌合，表現(xiàn)為多條染色體異常的無規(guī)律形式，每個細(xì)胞具有看似隨機(jī)的染色體數(shù)目。不同研究的標(biāo)準(zhǔn)和估計不同，其發(fā)生率約為25%[6]。

2 嵌合胚胎的發(fā)生機(jī)制

2.1 分裂后期延遲 即細(xì)胞分裂發(fā)生在染色體正確排列并附著于有絲分裂紡錘體之前，使某一條染色單體未能進(jìn)入子代細(xì)胞核[3]，形成一個單體和一個二倍體細(xì)胞。在移植前胚胎中，染色體丟失導(dǎo)致的有絲分裂錯誤比染色體增加更常見，出現(xiàn)在超過50%的病例中[7]。Ioannou等[8]在對丟棄的第5天胚胎的研究中，證明單體嵌合比三體發(fā)生率高7倍，提示細(xì)胞分裂后期延遲可能是嵌合的主要原因。

胚胎基因組在四至八個細(xì)胞階段前基本處于非激活狀態(tài)，來自母親的蛋白質(zhì)和mRNA儲備調(diào)控前幾次有絲分裂[9]。最近有研究使用單細(xì)胞表達(dá)譜來鑒定非整倍體/整倍體和發(fā)育阻滯/正常的胚胎中差異表達(dá)的母體效應(yīng)基因，發(fā)現(xiàn)發(fā)育阻滯的受精卵中，有絲分裂檢查調(diào)控位點(diǎn)的相關(guān)基因下調(diào)，包括CDK1、CDK2、CHEK2、BUB1、BUB3、乳腺癌易感基因1（BRCA1）和ATR[10]。隨著母親年齡增加，輻射、毒性物質(zhì)、氧自由基累積，卵子質(zhì)量下降，線粒體受損或端?？s短都可致有絲分裂錯誤。高齡導(dǎo)致非整倍體發(fā)生率升高，但目前的數(shù)據(jù)和觀念認(rèn)為嵌合發(fā)生率與年齡無關(guān)。

卵裂期的胚胎有絲分裂檢查位點(diǎn)的作用薄弱，可能導(dǎo)致細(xì)胞周期在染色體完全復(fù)制并正確排列于有絲分裂紡錘體之前或清除損傷DNA之前就進(jìn)入M期[11]。延時成像研究表明，在沒有嚴(yán)格檢查調(diào)控的細(xì)胞周期中，有絲分裂保真度由于關(guān)鍵細(xì)胞周期節(jié)點(diǎn)的輕微偏差而下降，出現(xiàn)頻繁的后期延遲[12]。監(jiān)控M期染色體的分離依靠紡錘體裝配檢查位點(diǎn)（spindle assembly checkpoint，SAC），SAC降調(diào)可導(dǎo)致一條姐妹染色單體與紡錘體連接失敗，或者兩條姐妹染色單體連接到同極紡錘體上，以及一個著絲粒與兩極紡錘體同時連接。錯誤的連接使染色體向兩極的移動延遲，增加后期延遲的發(fā)生率[13]。寬松的細(xì)胞周期檢查位點(diǎn)也可導(dǎo)致細(xì)胞分裂跳過M期，DNA復(fù)制而細(xì)胞不分裂，形成四倍體嵌合。

2.2 有絲分裂不分離 即姐妹染色單體在有絲分裂過程中未分離，使兩條染色單體進(jìn)入同一個子代，形成一個三體和一個單體細(xì)胞的相互獲得/丟失的模式。其發(fā)生率與胚胎發(fā)育階段和所涉及的染色體有關(guān)，是卵裂期性染色體不分離的主要機(jī)制，而與減數(shù)分裂Ⅰ期和Ⅱ期常染色體非整倍體的形成關(guān)系甚微[3]。姐妹染色單體不分離或過早分離都與聚合蛋白的功能障礙有關(guān)。在小鼠模型中，敲除聚合蛋白基因會導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育阻滯[14]。而預(yù)期會出現(xiàn)發(fā)育阻滯的受精卵表現(xiàn)出一些聚合蛋白基因包括SMC3和分離酶抑制蛋白的表達(dá)差異[10]，因此聚合蛋白對有絲分裂保真度的重要性值得進(jìn)一步研究。

2.3 內(nèi)復(fù)制 是指染色體復(fù)制而沒有隨后的胞質(zhì)分裂，或者有絲分裂開始不久后隨即關(guān)閉，形成一個三體和一個二倍體細(xì)胞[3]。

2.4 染色體丟失 在細(xì)胞周期的任何時期發(fā)生的染色體丟失都可導(dǎo)致嵌合。

2.5 提前分離 指細(xì)胞間期DNA復(fù)制完成前即啟動細(xì)胞分裂過程。

2.6 斷裂-融合-橋循環(huán) 即染色體片段融合形成雙著絲粒染色體。細(xì)胞分裂時，每個著絲粒被拉向相反方向，染色體在新的位置斷裂，斷裂染色體片段復(fù)制后再融合，開始新的循環(huán)。這種錯誤會導(dǎo)致復(fù)雜的染色體重排而出現(xiàn)嵌合[15]。其發(fā)生是由于后期延遲的染色體并不直接退化，而是從主細(xì)胞核中分離出來，被包裹進(jìn)類似細(xì)胞核的微核中，易發(fā)生嚴(yán)重的DNA損傷[16]，形成雙著絲粒染色體，也易發(fā)生染色體碎裂，以隨機(jī)順序和方向重新組合，導(dǎo)致大量的染色體片段缺失和重排。當(dāng)多個染色體被分割進(jìn)入一個微核時，還可能導(dǎo)致易位[17]。微核可在隨后的有絲分裂中被重新吸收入細(xì)胞主核或與鄰近卵裂球融合，導(dǎo)致復(fù)雜的嵌合模式[12]。

另外，來自精子的中心體若出現(xiàn)異常會導(dǎo)致卵裂期胚胎的有絲分裂錯誤，產(chǎn)生嚴(yán)重的雜亂嵌合。調(diào)控中心體復(fù)制的有絲分裂激酶Polo-蛋白激酶4（Polo-like kinase4，PLK4）即使是輕微的過表達(dá)，也會導(dǎo)致中心粒過多，形成多余的中心體[18]，使細(xì)胞出現(xiàn)多極，產(chǎn)生多個子細(xì)胞，染色體隨機(jī)分配到子細(xì)胞中，導(dǎo)致雜亂嵌合。雙精受精也是造成中心體過多的一個路徑[19]。也有正常二倍體卵裂球出現(xiàn)多極有絲分裂的報道[20]。在受精過程中，精子的中心粒促使微管聚合形成精子星狀體，其引導(dǎo)精卵原核相融，并從卵子提供的細(xì)胞質(zhì)中募集中心體的成分。不育男性星狀體的形成比正常男性延遲。

3 嵌合胚胎的檢出率及影響因素

胚胎植入前遺傳學(xué)檢測（preimplantation genetic test，PGT）是對有遺傳缺陷高風(fēng)險的夫婦，通過體外受精，應(yīng)用分子、細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，在體外選擇正常胚胎植入，亦稱孕前診斷。最初的熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)能檢測的染色體數(shù)目有限。近年來發(fā)展迅速的全染色體篩查技術(shù)（comprehensive chromosome screening，CCS），包括定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）、單核苷酸多態(tài)性分析微陣列（single nucleotide polymorphismarray，SNP arrays）、微陣列比較基因組雜交（array comparative genomic hybridization，aCHG）及最新的新型高通量測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS），已經(jīng)可以準(zhǔn)確檢測23對染色體的拷貝數(shù)。

各種檢測方法估計卵裂期胚胎的嵌合率在15%～75%[21]。第5天/第6天囊胚期的滋養(yǎng)外胚層（trophectoderm，TE）活檢可以獲得更多細(xì)胞，檢測結(jié)果更加穩(wěn)定可信。囊胚嵌合率在3%～24%[22]，但是嵌合的類型、程度，活檢的位置、細(xì)胞數(shù)目都應(yīng)當(dāng)納入對TE活檢準(zhǔn)確性的評估中。全基因組檢測技術(shù)不能發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)的染色體異常；不同的嵌合形式使單次TE活檢在理論上很容易出現(xiàn)誤診[2]，其能否代表整個胚胎的倍性狀態(tài)，仍存在爭議。Johnson等[23]和Capalbo等[24]的研究提示TE和ICM的一致性高達(dá)95%～100%。Maxwell等[25]對TE+NGS檢測為嵌合體的胚胎進(jìn)行2～5次重復(fù)的TE檢測，再次TE檢測認(rèn)為48.2%仍為嵌合體，51.7%為整倍體?？梢奣E活檢對ICM的代表性存在一定的誤差。PGDIS推薦活檢5個細(xì)胞。Gleicher等[26]經(jīng)過數(shù)學(xué)模型計算，認(rèn)為每次活檢至少27個細(xì)胞，才能代表約含300個細(xì)胞的TE。

在嵌合胚胎的檢測中，除了生物學(xué)因素導(dǎo)致的困難，還有檢測方法數(shù)據(jù)分析帶來的挑戰(zhàn)[27]。不同的全基因組擴(kuò)增和檢測平臺、分析軟件及設(shè)置、嵌合評估原則和標(biāo)準(zhǔn)都會影響檢測結(jié)果[21]。所使用的PGT嵌合檢測敏感度（即整倍體和非整倍體細(xì)胞混合物中可檢出嵌合的最小非整倍體細(xì)胞比例）也會影響嵌合檢出率。2016年P(guān)GDIS指南提出，有效的NGS平臺現(xiàn)需要能夠發(fā)現(xiàn)嵌合率為20%左右的胚胎。

此外，一項大樣本的回顧性隊列研究表明，PGT平均整倍體率約39.5%～82.5%，平均68.4%，各個生殖中心間有差異。不同中心的不同卵巢刺激方案、激素水平及實(shí)驗(yàn)室因素是否影響嵌合率，不同的研究結(jié)果相反，有待進(jìn)一步研究。Munne等[28]認(rèn)為，胚胎培養(yǎng)條件及培養(yǎng)液可導(dǎo)致嵌合現(xiàn)象的差異。與大氣氧含量相比，5%的氧氣培養(yǎng)環(huán)境可以提高胚胎質(zhì)量，降低性染色體嵌合。

4 臨床結(jié)局

嵌合胚胎的發(fā)育潛力、種植率下降，遺傳疾病、不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險增加。有嚴(yán)重精神障礙和自身免疫性疾病的個體染色體嵌合發(fā)生率較高的報道[2]。在最初胚胎檢測結(jié)果定性為整倍體和非整倍體時，認(rèn)為只有整倍體胚胎可以孕育健康后代，但Greco等[29]2015年的研究表明一部分嵌合體胚胎可以發(fā)育為健康活產(chǎn)兒，Munné等[30]2017年的研究表明，41%嵌合胚胎移植后可以獲得繼續(xù)妊娠。因此嵌合體胚胎很可能有自我糾錯的潛能，應(yīng)重新考慮嵌合胚胎的選擇性移植。正常4～8細(xì)胞階段由于逐漸下降的核質(zhì)比而觸發(fā)胚胎基因組激活（embryonic genome activation，EGA），細(xì)胞分裂保真度增加。染色體不分離的發(fā)生率從第一次有絲分裂時的＞25%降至8細(xì)胞階段后的＜5%。與卵裂期相比，囊胚的嵌合比例下降，染色體異常所致的嚴(yán)重程度下降。有3種假說解釋這種現(xiàn)象：第1種，嵌合胚胎在形成囊胚前已凋亡。第2種，非整倍體細(xì)胞主動清除，或較整倍體細(xì)胞增殖速度更慢。最近一項使用小鼠模型的研究支持這一假說，證明當(dāng)二倍體細(xì)胞的比例足夠大（≥50%）時，嵌合胚胎可以完成自我糾正[31]。特定細(xì)胞系的克隆消耗可以解釋CPM的發(fā)生。第3種，單/三倍體補(bǔ)救，即非整倍體細(xì)胞再次有絲分裂錯誤而成為二倍體，這種補(bǔ)救機(jī)制相對少見，且可導(dǎo)致與廣泛臨床疾病相關(guān)的UPD，其發(fā)生率有待研究。

目前還不能明確胚胎嵌合比例對發(fā)育潛力的影響，但是比例較低的胚胎著床機(jī)會大。非整倍體細(xì)胞占40%～80%的嵌合胚胎，持續(xù)妊娠率（ongoing implantation rate，OIR）約為22%，＜40%的嵌合胚胎OIR則高達(dá)56%，復(fù)雜嵌合類型胚胎的OIR（10%）明顯較低，單倍體、三倍體及節(jié)段性嵌合體OIR的差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義[30]。采用分級系統(tǒng)預(yù)測嵌合胚胎插入類型，可能改善PGS后IVF結(jié)局[21]。

任何情況下都優(yōu)先移植整倍體胚胎，對于IVF的患者尤其是高齡婦女，若所獲胚胎只有嵌合體，且患者不能或不愿經(jīng)歷再次取卵，可根據(jù)胚胎嵌合程度、染色體異常類型，結(jié)合患者的既往史和自我期望，選擇移植遺傳風(fēng)險較低的胚胎。由于常染色體單體通常不能存活，而特定的三體可致活產(chǎn)兒身體或認(rèn)知缺陷[32]，PGDIS2016年指南建議優(yōu)先移植單體嵌合而非三體嵌合，若移植三體嵌合，1、3、4、5、6、8、9、10、11、12、17、19、20、22 、X和Y染色體三體嵌合胚胎優(yōu)先移植，2、7、13、14、15、16、18和21染色體三體嵌合胚胎不優(yōu)先移植。希望所選擇的胚胎有“全或無”效應(yīng)，即胚胎種植、妊娠后可以活產(chǎn)完全健康的孩子，或種植失敗、早期流產(chǎn)，從而避免不良妊娠結(jié)局。然而PGDIS指南也指出，由于缺乏足夠的臨床證據(jù)，嵌合胚胎仍有待各方面的進(jìn)一步研究。但目前對于移植前與患者充分的遺傳咨詢已達(dá)成共識，需告知嵌合胚胎結(jié)局的不確定性和流產(chǎn)、胎兒異常、妊娠終止等各種可能的風(fēng)險，并建議其進(jìn)行早期的產(chǎn)前篩查和后期的羊水穿刺檢查。

5 結(jié)語

由于嵌合胚胎形成機(jī)制的復(fù)雜性及發(fā)育過程的未知性，目前還不能建立基因型和表型的聯(lián)系，在胚胎發(fā)育過程中，為何部分細(xì)胞發(fā)生有絲分裂錯誤，尚不清楚。每個嵌合個體的異常細(xì)胞比例、染色體異常的類型和組織部位均不同，個體差異大，因此發(fā)育結(jié)局極不確定[33]。目前關(guān)于移植嵌合胚胎后臨床結(jié)局的數(shù)據(jù)還非常缺乏。NGS應(yīng)用的增加、數(shù)據(jù)的搜集及妊娠隨訪有望提供關(guān)于嵌合胚胎發(fā)育結(jié)局更為詳細(xì)的觀點(diǎn)。