信 波,龐海林,申煒煒,張開(kāi)亮,張 蕾,張立成,張賀龍*

(1解放軍第88醫(yī)院腫瘤科,泰安 271000;2空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科;3解放軍第88醫(yī)院骨科;*通訊作者,E-mail:cnxazhl@163.com)

肺癌是目前世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的腫瘤,其引起的死亡占所有腫瘤導(dǎo)致死亡的20.6%[1]。肺癌的主要組織學(xué)類(lèi)型是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC),占所有肺癌的80%-85%[2]。

雌激素是人體內(nèi)一類(lèi)重要的類(lèi)固醇性激素。它調(diào)節(jié)著體內(nèi)眾多的生理功能,如細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖、發(fā)育和分化。雌激素除了對(duì)正常的細(xì)胞和生理過(guò)程產(chǎn)生影響外,還在諸如腫瘤、代謝病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、炎癥、骨質(zhì)疏松等病理過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。雌激素主要通過(guò)雌激素受體(estrogen receptor,ER)發(fā)揮這些作用[3],而ER又分為ERα和ERβ兩類(lèi)。

近年來(lái),雌激素在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用受到了廣泛關(guān)注[4]。已有文獻(xiàn)報(bào)道,與正常肺細(xì)胞相比,NSCLC組織中存在有大量ER[5]。而人體內(nèi)雌激素主要為雌二醇,因此,本實(shí)驗(yàn)旨在探討雌二醇對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖能力的影響,為其臨床應(yīng)用提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人類(lèi)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物研究所);RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco,美國(guó));E2(17β-雌二醇,Sigma,美國(guó));PPT(雌激素受體α激動(dòng)劑,TOCRIS,英國(guó));DPN(雌激素受體β激動(dòng)劑,TOCRIS,英國(guó));MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、結(jié)晶紫染色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)使用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10% FBS、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素)培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞和H1299細(xì)胞。每次取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞分別用三種藥物(E2、PPT、DPN)各作用24 h和48 h。取生長(zhǎng)至鋪滿(mǎn)瓶底80%左右的A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞,常規(guī)消化;按每孔1 000個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種至96孔板,為了去除FBS中可能存在的激素所帶來(lái)的影響,待細(xì)胞貼壁后,換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,而后在96孔板內(nèi)按濃度梯度(0,10-10,10-9,10-8,10-7,10-6mol/L)加入E2,按濃度梯度(0,10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L)加入PPT或DPN,每個(gè)濃度設(shè)立5個(gè)復(fù)孔;“十字形”晃動(dòng)培養(yǎng)板,使細(xì)胞分布均勻,放入培養(yǎng)箱;加入相關(guān)試劑后的第24小時(shí)和48小時(shí)分別用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況,并分析得出的數(shù)據(jù)。

1.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和H1299細(xì)胞用胰酶消化,重懸后制成單細(xì)胞懸液;于6孔板培養(yǎng)板中接種200個(gè)細(xì)胞/孔,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3個(gè)復(fù)孔;將接種好的細(xì)胞于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 d,然后換無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,而后在無(wú)血清培養(yǎng)液中加入相應(yīng)濃度的E2、PPT和DPN培養(yǎng)24 h和48 h,然后換新鮮完全細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)5 d;肉眼可見(jiàn)克隆形成或鏡下可觀察到絕大多數(shù)單克隆中細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)為止(中途每3 d進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài))。每孔加入95%酒精1 ml,固定細(xì)胞20 min;PBS漂洗細(xì)胞1次;每孔加入1%結(jié)晶紫染液1 ml,染細(xì)胞15 min;將六孔板浸泡至流水中洗滌,直至洗凈板上背景,晾干;數(shù)碼相機(jī)拍照整張板,并對(duì)肉眼可見(jiàn)克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

按每孔2×105個(gè)細(xì)胞的數(shù)量將細(xì)胞接種至六孔板中,待細(xì)胞貼壁后加入無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h;分別加入相應(yīng)濃度的E2、PPT和DPN,繼續(xù)孵育48 h;收集1×105-5×105個(gè)細(xì)胞,加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞;加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC混勻,再加入Annexin Ⅴ-FITC Propidim Iodin 5 μl;室溫避光反應(yīng)5-10 min。1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 細(xì)胞周期檢測(cè)

按每孔2×105個(gè)細(xì)胞的數(shù)量將細(xì)胞接種至6孔板,待細(xì)胞貼壁后加入無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h;分別加入相應(yīng)濃度的E2、PPT和DPN,繼續(xù)孵育48 h;收集1×105-5×105個(gè)細(xì)胞;加入1 ml 70%冰乙醇,4 ℃固定12-24 h;1 000g離心5 min,棄上清;加入1 ml預(yù)冷過(guò)的PBS漂洗1次,1 000g離心5 min,棄去上清液,輕彈離心管底以分散細(xì)胞。管內(nèi)加入500 μl碘化丙啶染色液,充分混勻,37 ℃避光反應(yīng)30 min。4 ℃避光存放,于24 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀在400 nm處檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。根據(jù)不同的數(shù)據(jù)類(lèi)型,采取相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法如方差分析、One-way ANOVA和Stutent’st檢驗(yàn),數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E2與DPN均可促進(jìn)A549細(xì)胞增殖

為了排除完全培養(yǎng)基內(nèi)血清中可能含有的激素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,在加入E2、PPT和DPN前24 h即用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,加入E2、PPT和DPN后繼續(xù)用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。由于細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中無(wú)法正常分裂生長(zhǎng),所以本實(shí)驗(yàn)只觀察加入E2、PPT和DPN后48 h內(nèi)(即無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞72 h)三者對(duì)細(xì)胞的影響。且以未添加相應(yīng)試劑的無(wú)血清培養(yǎng)基為對(duì)照組。

本實(shí)驗(yàn)觀察A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞在不同濃度E2、PPT和DPN作用下增殖的變化時(shí),結(jié)果顯示當(dāng)E2濃度為10-8mol/L,作用48 h,可以促進(jìn)A549細(xì)胞增殖(P<0.05,見(jiàn)圖1)。當(dāng)PPT作用于A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞24 h,在10-4mol/L和10-5mol/L高濃度下,兩種細(xì)胞幾乎全部死亡(P<0.05),可能由于藥物濃度較大時(shí),其毒性作用導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡;而當(dāng)其濃度稀釋至10-6mol/L后,對(duì)增殖沒(méi)有明顯的影響(P>0.05,見(jiàn)圖2)。當(dāng)DPN濃度處于10-6-10-8mol/L時(shí),作用48 h,可以促進(jìn)A549細(xì)胞增殖(P<0.05,見(jiàn)圖3)。表明雌激素及ERβ激動(dòng)劑DPN對(duì)A549細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用具有濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。

與對(duì)照組相比,*P<0.05圖1 不同濃度的E2對(duì)A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞增殖的影響Figure 1 The effect of E2 on proliferation of A549 and H1299 by MTT assay

2.2 雌激素及其α和β受體激動(dòng)劑對(duì)肺癌細(xì)胞克隆形成能力的影響

根據(jù)已有的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并結(jié)合參考文獻(xiàn),選擇E2、PPT、DPN的作用濃度均為10-8mol/L,以此作為給藥劑量,且以未添加相應(yīng)試劑的無(wú)血清培養(yǎng)基為對(duì)照組。在接種細(xì)胞14 d后,對(duì)各組細(xì)胞形成的克隆進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果顯示:E2和DPN對(duì)A549細(xì)胞作用48 h,可以顯著提高細(xì)胞的克隆形成能力(P<0.05,見(jiàn)圖4)。而E2、PPT、DPN對(duì)H1299細(xì)胞的克隆形成能力沒(méi)有明顯的影響(P>0.05,見(jiàn)圖5)。表明E2和DPN均可提高A549細(xì)胞的克隆形成能力。

2.3 雌激素及其β受體激動(dòng)劑對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)在體外,E2和DPN均可以促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖,而E2、PPT和DPN對(duì)H1299細(xì)胞的增殖并未發(fā)揮明顯的促進(jìn)作用。為進(jìn)一步探索雌激素和DPN如何影響A549細(xì)胞增殖的機(jī)制,我們利用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)加E2和DPN后對(duì)A549細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期的影響,以無(wú)血清培養(yǎng)基為對(duì)照組。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,E2和DPN并未影響A549細(xì)胞的凋亡,E2組、DPN組、對(duì)照組凋亡率分別為1.5%±0.8%,1.6%±0.6%,1.8%±0.5%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)圖6)。E2和DPN可以使A549細(xì)胞處于G1期的比例減少,而處于S期的細(xì)胞比例增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖7,表1)。提示E2和DPN能夠促進(jìn)細(xì)胞G1-S周期進(jìn)程,提高細(xì)胞增殖能力。

與對(duì)照組相比,*P<0.05圖2 不同濃度的PPT對(duì)A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞增殖的影響Figure 2 The effect of PPT on proliferation of A549 and H1299 by MTT assay

與對(duì)照組相比,*P<0.05圖3 不同濃度的DPN對(duì)A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞增殖的影響Figure 3 The effect of DPN on proliferation of A549 and H1299 by MTT assay

與對(duì)照組相比,*P<0.05圖4 E2、PPT、DPN對(duì)A549細(xì)胞克隆形成能力的影響Figure 4 The effects of E2, PPT and DPN on colony forming abilities of A549 cells

圖5 E2、PPT、DPN對(duì)H1299細(xì)胞克隆形成能力的影響Figure 5 The effects of E2, PPT and DPN on colony forming abilities of H1299 cells

A. E2組 B. DPN組 C.對(duì)照組圖6 E2和DPN作用24h對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響Figure 6 Effects of E2 and DPN on apoptosis of A549 cells

A. E2組 B. DPN組 C.對(duì)照組圖7 E2和DPN促進(jìn)A549細(xì)胞G1-S周期進(jìn)程Figure 7 E2 and DPN promoted G1-S phase of A549 cell cycle

表1E2和DPN對(duì)A549細(xì)胞G1-S周期的影響

Table1EffectsofE2andDPNonG1-SphaseofA549cellcycle

組別G1期S期G2期E2組50.98±3.3?33.71±2.6?15.31±1.8 DPN組55.43±4.1?26.05±3.5?18.62±1.9對(duì)照組70.03±3.220.10±2.29.67±1.5

與對(duì)照組比較,*P<0.05

3 討論

雌激素是一類(lèi)非常重要的甾體類(lèi)性激素,通過(guò)與其不同的受體結(jié)合形成E2/ER復(fù)合物,從而促進(jìn)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育和維持多系統(tǒng)器官的功能。ER主要表達(dá)于子宮、腦、肝臟、卵巢、乳腺、男性生殖系統(tǒng)、肺以及骨骼組織。ER作為核受體蛋白超家族中的重要一員,主要和小分子疏水配體結(jié)合,主要包括ERα、ERβ兩種亞型[6]。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,肺癌尤其是非小細(xì)胞肺癌,雌激素與其發(fā)生和進(jìn)展緊密相關(guān)。與正常肺細(xì)胞相比,肺癌細(xì)胞含有大量的ER[7]。ERα和ERβ具有不同的組織分布。在正常的肺細(xì)胞和惡性肺細(xì)胞內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了ERβ。但是,ERα卻在正常肺細(xì)胞里很少存在,而是在肺癌細(xì)胞內(nèi)大量存在[8]。雖然ERα和ERβ識(shí)別相似的靶DNA序列,對(duì)E2的應(yīng)答也相似,但它們對(duì)DNA的親和力以及配體識(shí)別的特異性有所不同。而且在不同腫瘤中,發(fā)揮作用的ER也有所不同[9]。此外,在共表達(dá)ERα和ERβ的組織中,ERα的轉(zhuǎn)錄活性比ERβ略強(qiáng),但ERβ具有減弱ERα的作用[10]。那么,雌激素在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖中又是通過(guò)與哪個(gè)受體結(jié)合后發(fā)揮作用呢?

針對(duì)這一問(wèn)題,本研究通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)篩選出了雌激素(E2)、ERα激動(dòng)劑(PPT)和ERβ受體激動(dòng)劑(DPN)對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299的有效作用濃度和作用時(shí)間。結(jié)果顯示:E2和DPN可以促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖,而對(duì)H1299的增殖沒(méi)有影響。PPT在高濃度時(shí),可嚴(yán)重抑制這兩種細(xì)胞的增殖,低濃度時(shí)則無(wú)明顯作用。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示,E2及DPN促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖,而對(duì)H1299細(xì)胞不具有類(lèi)似的作用;而PPT對(duì)兩種細(xì)胞的增殖無(wú)明顯的促進(jìn)作用。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示E2和DPN通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞G1-S周期進(jìn)程,提高細(xì)胞增殖能力。

綜上,E2是通過(guò)ER起作用,當(dāng)ERβ被激活時(shí),可以促進(jìn)A549細(xì)胞增殖,而激活ERα對(duì)A549細(xì)胞則沒(méi)有任何相應(yīng)的作用,所以本研究的結(jié)果提示E2激活ERβ后可促進(jìn)A549細(xì)胞在體外的增殖。這為探索肺癌的發(fā)病機(jī)制以及尋找新的治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。