智沐君 陳立園 袁 月 王富春 劉曉娜

近年來，隨著人們生活方式的改變，糖尿病(diabetes mellitus, DM)成為世界上第三大非傳染性疾病[1]，發(fā)病率逐年上升[2]。糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis, DGP)是DM眾多并發(fā)癥之一[3]，主要表現(xiàn)為胃動力障礙、胃排空延遲等一系列綜合癥狀[4]，有近30%～50%的DM患者出現(xiàn)胃排空障礙癥狀[5]。因此，DGP的發(fā)病機(jī)理及治療方法的研究備受世人的關(guān)注，而選擇合理的DGP動物模型是研究DGP的基礎(chǔ)，至關(guān)重要?，F(xiàn)代研究證明針灸能夠改善胃運(yùn)動，減輕DGP的臨床癥狀[6]，美國胃腸病學(xué)雜志發(fā)布的胃輕癱臨床管理指南中多次提到針灸的有效性。現(xiàn)有多種方法和途徑建立DGP動物模型，本文對其做以下的綜述，并探討其在針灸治療DGP的機(jī)制研究的應(yīng)用。

1 針灸對DGP研究的主要方向

針灸是治療糖尿病胃輕癱的一種有效的治療手段，因其具有多靶點(diǎn)、非特異性等特點(diǎn)，其治療機(jī)制研究尚需深入。

1.1 降糖張卉等[7]觀察了壯醫(yī)線點(diǎn)灸的方法對糖尿病胃輕癱大鼠胃腸推進(jìn)率和血糖的影響，采用的是一次性鏈脲佐菌素腹腔注射配合高脂高糖飼料及不規(guī)則飲食法制備的糖尿病胃輕癱模型，治療后大鼠的血糖明顯降低，且胃腸推進(jìn)率得到了有效的提高。

1.2 修復(fù)平滑肌陳小麗等[8]觀察到針刺能夠促進(jìn)胃竇平滑肌組織RhoA、ROCK等蛋白表達(dá)，從而增強(qiáng)了磷酸化肌球蛋白輕鏈的水平，從而起到改善糖尿病胃輕癱癥狀的作用。采用的是鏈脲佐菌素腹腔注射配合8周的普通喂養(yǎng)形成的DGP模型。

1.3 胃腸激素研究顯示針刺能夠調(diào)節(jié)多種胃腸激素狀態(tài)。李秀紅等[9]觀察了電針對糖尿病胃輕癱大鼠胃動素(MOT)及生長抑素(SS)的影響，采用的是DM模型成模后采用高脂高糖飼料自由進(jìn)食喂養(yǎng)10周確認(rèn)成DGP模型，結(jié)果顯示電針能夠改善糖尿病胃輕癱大鼠高胃動素和高生長抑素的狀態(tài)。

1.4 調(diào)整胃電節(jié)律梅志剛等[10]觀察了針?biāo)幝?lián)合對糖尿病胃輕癱動物的胃腸動力和胃肌電活動，采用的模型是鏈脲佐菌素配合高脂高糖飼料喂養(yǎng)形成的DGP模型。結(jié)果顯示針?biāo)幗Y(jié)合可以提高糖尿病胃輕癱小鼠的胃腸動力，改善胃電節(jié)律，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)整胃竇部ICC數(shù)量或改善其結(jié)構(gòu)，使胃電節(jié)律恢復(fù)、胃腸蠕動功能提高。

2 DGP模型的選擇

一個成功的DM模型是DGP模型成功的基礎(chǔ)。常用的DM造模方法有鏈脲佐菌素(STZ)法、四氧嘧啶(ALX)法、注射葡萄糖法、高脂飲食法等。但單一的藥物注射造模只能制作出DM模型，結(jié)合糖尿病胃輕癱的成因，DGP模型多在DM模型的基礎(chǔ)上配合飲食進(jìn)行造模。

2.1 鏈脲佐菌素法配合飲食STZ能夠選擇性破壞胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致胰島內(nèi)胰島素合成和分泌減少，從而引發(fā)DM[11]。小劑量多次注射可以造成2型糖尿病模型，大劑量單次注射可造成1型糖尿病模型。陳霞等[12]使用0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液配制的2% STZ一次性注射到SD大鼠腹腔內(nèi)(60 mg/kg)。在造模后3 d開始測空腹血糖，血糖持續(xù)1周達(dá)到16.9 mmol/L判定為糖尿病模型造模成功，并在造模成功后10周進(jìn)行胃腸動力檢測，判定糖尿病胃輕癱造模成功。柏曉輝等[13]使用小劑量STZ聯(lián)合高能量飲食法進(jìn)行DGP模型造模，在SD大鼠高能量飼料喂養(yǎng)4周后，腹腔注射0.1 mmol/L的枸櫞酸緩沖液配制成的STZ溶液(20 mg/kg)；3 d后進(jìn)行第2次注射，劑量為25 mg/kg；第2次注射后3 d進(jìn)行第3次注射，劑量為35 mg/kg。在造模后測定血糖和胃內(nèi)殘留率作為檢測成模指標(biāo)，血糖界限為16.9 mmol/L。其中高能量飼料配方為碳水化合物61%，脂肪14%，蛋白質(zhì)14%，蔗糖10%，膽固醇1%。萬全荃等[14]使用單次55 mg/kg腹腔注射2%的STZ配合高脂飼料不規(guī)則喂養(yǎng)8周來建立DGP模型。不規(guī)則喂養(yǎng)采取高糖高脂飼料單日上午和雙日下午進(jìn)食。成模標(biāo)準(zhǔn)為血糖≥16.7 mmol/L，尿糖陽性，胃排空率和小腸推進(jìn)率與對照組有明顯差異。高脂飼料的比例為普通飼料58%，熟豬油15%，蔗糖20%，奶粉5%，雞蛋2%。張琴等[15]使用1%STZ腹腔注射(50 mg/kg)結(jié)合飲食失節(jié)法進(jìn)行糖尿病胃輕癱模型造模，大鼠品種選擇的是雄性Wistar大鼠。飲食失節(jié)法具體操作為喂養(yǎng)高熱量飼料，采取單日上午進(jìn)食和雙日下午進(jìn)食的原則，飼養(yǎng)周期為6周。高熱量飼料的比例為碳水化合物51%，脂肪25%，蛋白質(zhì)14%。判定成模方法為血糖監(jiān)測和胃殘留率檢測。

2.2 四氧嘧啶(ALX)法配合飲食使用四氧嘧啶對胰島細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)損傷，是1型糖尿病動物模型常用方法之一，操作簡單，成本低廉。ALX通過產(chǎn)生超氧自由基與富含-SH的胰島β細(xì)胞特異性結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)DNA損傷，并激活多聚ADP核糖體合成酶的活性，導(dǎo)致mRNA功能受損，β細(xì)胞合成前胰島素減少，最終導(dǎo)致胰島素缺乏[16]。吳國泰等[17]使用正交試驗法優(yōu)化了ALX法復(fù)制糖尿病胃輕癱模型，最終推薦1個月的標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，注射ALX的劑量為250 mg/kg。張玉等[18]使用ALX聯(lián)合飲食失節(jié)法成功誘導(dǎo)了家兔糖尿病胃輕癱模型，其中ALX的濃度為10%，飲食失節(jié)法使用高糖高脂飼料不規(guī)律喂養(yǎng)2周。通過血糖和胃排空率來判定是否成模。高糖高脂飼料比例為常規(guī)飼料66.5%，豬油10%，蔗糖20%，膽固醇2.5%，膽酸鹽1%。孫澤庭[19]選用Wister大鼠進(jìn)行ALX造模糖尿病模型，3 d后灌服熟地黃，濃度為200%，按照2 ml/100 g進(jìn)行，持續(xù)進(jìn)行2周。熟地黃是滋陰補(bǔ)血的一味中藥，主要用于陰血不足等癥，現(xiàn)代研究表明熟地黃能夠明顯抑制小鼠胃腸推進(jìn)運(yùn)動和家兔離體小腸平滑肌的自發(fā)活動[20]，同時大劑量的熟地黃有明顯的升糖作用[21]。實(shí)驗后通過觀察大鼠的血糖穩(wěn)定程度和MMCⅢ期運(yùn)動減弱或消失來判定糖尿病胃輕癱模型造模成功。秦明等[21]選擇5%的四氧嘧啶水溶液以120 mg/ml給大鼠連續(xù)注射2 d，后以200%的熟地黃進(jìn)行灌服，并在2周后判定為胃功能障礙模型。

2.3 自發(fā)性模型隨著技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已有多種自然條件下發(fā)生糖尿病的動物模型，其發(fā)病進(jìn)程與人類更為相似，具有較高的應(yīng)用價值。如瘦素基因純合突變的ob/ob小鼠[23]、瘦素受體基因純合突變的db/db小鼠[24]、新西蘭肥胖小鼠(New Zwaland obses mice, NZO mice)[25]、M16小鼠[26]、ZDF大鼠[27]等，其均可以結(jié)合不規(guī)則飲食喂養(yǎng)建立糖尿病胃輕癱模型。但自發(fā)性模型多價格昂貴，飼養(yǎng)費(fèi)用及條件十分嚴(yán)格，動物的繁殖率低等，導(dǎo)致自發(fā)性模型并不作為基礎(chǔ)研究的首要選擇。

3 DGP模型評價指標(biāo)

一個成功的動物模型建立需要有合適的評價指標(biāo)作為例證。因此在基礎(chǔ)研究中除了選擇一個合適的動物載體外，還需要根據(jù)實(shí)驗需求選擇合適的評價指標(biāo)。

3.1 血糖血糖作為最直接的指標(biāo)，常用來判定是否成功建立糖尿病模型，常用的糖尿病模型判定使用的是血糖大于11.1 mmol/L。楊建文等[28]根據(jù)血糖大于等于16.7 mmol/L，判定DGP模型成功。

3.2 胃內(nèi)殘留率胃內(nèi)殘留率檢測[29]前需禁食不禁水24 h，灌胃半固體糊狀物2 ml/只，30 min后處死，取胃，稱胃全重，隨后沿胃大彎剖開，除去內(nèi)容物后再次稱重，以(胃全重-胃凈重)/糊重×100%為胃內(nèi)殘留率。

3.3 胃排空率測定胃排空率測定前需禁食24 h，禁水2 h，操作前以50 mg/dl的酚紅溶液2 ml灌胃20 min后立即處死，取出全胃并沿胃大彎切開，沖洗胃內(nèi)容物，定容為20 ml，加入0.5 ml/L的NaOH 20 ml攪拌均勻后靜置1 h，取5 ml上清液，加入三氯乙酸0.5 ml去蛋白后離心，取上清液用分光光度計測定560 nm的波長下的吸光度值(OD)。另制備2 ml酚紅溶液，18 ml蒸餾水、0.5 mol/L NaOH 20 ml、三氯乙酸4 ml攪拌均勻，測定吸光度值。大鼠的胃排空率=(1-實(shí)測酚紅吸光度/標(biāo)準(zhǔn)酚紅吸光度)×100%。

3.4 小腸推進(jìn)率測定小腸推進(jìn)率測定常與胃排空測定同時使用，是在胃排空測定的同時取出小腸，并將其平鋪于白紙上，測定幽門至回盲部全長及幽門至酚紅所到距離，小腸推進(jìn)率=酚紅在小腸中的移行距離/小腸全長×100%。

3.5 墨汁灌胃法墨汁灌胃法[8]與小腸推進(jìn)率原理相似，區(qū)別在灌胃物質(zhì)為黑色墨水，比例為1 ml/100 g，灌胃20 min麻醉處死，取出幽門至回盲部的腸管，測量墨團(tuán)距離及腸道全長。小腸推進(jìn)率=墨水前端至幽門括約肌距離/幽門括約肌至小腸末端距離×100%。

3.6 MMCⅢ運(yùn)動幅度檢測MMCⅢ是指胃竇部在消化間期移行性復(fù)合運(yùn)動Ⅲ期，糖尿病胃輕癱患者除了早飽、胃排空延遲等癥狀外，一般都伴有餐后胃竇部MMCⅢ期收縮波的減弱或消失，因此可采用多媒體生理記錄儀連接的應(yīng)力傳感器固定在大鼠的胃黏膜上，測定其胃的機(jī)械收縮運(yùn)動波，并對MMCⅢ 運(yùn)動幅度進(jìn)行記錄觀察，從而判定是否形成DGP模型[19]。

3.7 胃排空閃爍掃描法胃排空閃爍掃描是利用SPECT/CT技術(shù)，對胃排空的各個時間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時記錄。在臨床中胃排空閃爍掃描被稱為胃排空評價的“金指標(biāo)”[30]。

4 討論

用動物模型復(fù)制人類疾病進(jìn)行病因研究與改進(jìn)疾病防治方法是醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要途徑。任何一種模型制備方法均有一定局限性，有待在不斷的探索中進(jìn)一步深入與細(xì)化。現(xiàn)階段建立DM動物模型的技術(shù)方法已較為成熟，但在DGP模型的建立上卻各有各不同，主要是因為并未有一種標(biāo)準(zhǔn)化的判定標(biāo)準(zhǔn)對糖尿病胃輕癱模型進(jìn)行客觀評價?，F(xiàn)有最常用的判定標(biāo)準(zhǔn)是采用小腸推進(jìn)率和胃腸排空，但在操作過程中需處死大鼠進(jìn)行測量，在針灸基礎(chǔ)研究中并不適用。因此我們需要尋找到一種可以不打斷完整證據(jù)鏈的基礎(chǔ)上的客觀判定標(biāo)準(zhǔn)，在后續(xù)的研究中，我們將尋找一種在不傷害動物的前提下進(jìn)行的一種胃排空測定，為糖尿病胃輕癱動物模型的判定找尋一種新的方法。