詹得文， 胡文龍， 殷嫦嫦

1九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/九江市轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室(江西九江 332000)； 2九江學(xué)院附屬醫(yī)院骨科(江西九江 332000)

骨肉瘤(osteosarcoma)是兒童和青少年中最常見、具有高度惡性和侵襲性的原發(fā)性骨腫瘤[1]。目前，新輔助化療是骨肉瘤治療主要方式[2]，在其剛興起的時候骨肉瘤患者的生存有所改善(5年總體存活率提高到60%～70%)，但近幾十年來在這一領(lǐng)域幾乎沒有取得任何進展，化療抵抗和肺轉(zhuǎn)移仍是骨肉瘤患者最具代表性的死亡原因。如果對骨肉瘤能夠?qū)崿F(xiàn)早期診斷，且有良好的監(jiān)測、療效觀察以及預(yù)后等方面的評估指標(biāo)，將有利于骨肉瘤的診療活動。在這些方面，微RNA(miRNA)由于其特異性強、選擇性專一和準(zhǔn)確性高等特性成為評價骨肉瘤的理想指標(biāo)而進入了人們的視野。miRNA 是一段大小約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA，于轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白的表達[3]。多項研究顯示，miRNA除了具有調(diào)節(jié)各種正常生理功能外，還參與了骨肉瘤的發(fā)病機制，且很有可能在疾病的診斷與治療中起著重要的作用，其中發(fā)現(xiàn)miRNA-143(miR-143)與骨肉瘤發(fā)病密切相關(guān)[4-8]。因此，本研究就近年來miR-143與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機制進展作一綜述。

1 miR-143與骨肉瘤概述

miRNA在包括骨肉瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤中可能表現(xiàn)為致癌或抑癌基因的作用，其中miR-143在骨肉瘤組織中明顯下調(diào)，表現(xiàn)為抑癌基因的作用[3]。骨肉瘤患者血漿中miR-143的含量明顯下降，被認(rèn)為是區(qū)別骨肉瘤患者和健康人的標(biāo)志物[9]。Wei等[10]在150例骨肉瘤患者中研究發(fā)現(xiàn)，miR-143 在骨肉瘤組織樣本低表達，且miR-143低表達水平與腫瘤體積呈負(fù)相關(guān)，而與總生存時間和無病生存期均呈正相關(guān)。多變量分析發(fā)現(xiàn)miR-143的低表達是骨肉瘤預(yù)后不良的獨立危險因素。Fang等[11]也報道，隨著骨肉瘤惡性程度的增加，miR-143的表達呈降低趨勢，而上調(diào)miR-143表達可能會影響腫瘤進程。miR-143可下調(diào)骨肉瘤U2細(xì)胞系中hERG基因(其性質(zhì)為一種電壓門控性鉀離子通道)mRNA和蛋白的表達[12]。hERG在骨肉瘤細(xì)胞中高表達，且hERG可作為癌基因參與骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡過程，其調(diào)控機制可能與NF-κB信號通路有關(guān)[13]。

此外，miR-143表達高度保守，能通過與靶基因特異性結(jié)合進而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進細(xì)胞凋亡等生物學(xué)效應(yīng)，還能增加抗腫瘤藥物的敏感性[14]。鑒于此，若能闡明miR-143與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移之間的作用機制，對骨肉瘤的治療將更有益處。

2 miR-143與骨肉瘤增殖

體外上調(diào)miR-143的表達能明顯降低骨肉瘤細(xì)胞的生存能力，促進細(xì)胞凋亡；而上調(diào)體內(nèi)骨肉瘤細(xì)胞中miR-143的表達可導(dǎo)致腫瘤的生長受限，瘤體體積明顯減小[15]。 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路是最常見被激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與了骨肉瘤的發(fā)生與發(fā)展；此通路的激活具有促進細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移以及抑制細(xì)胞凋亡和血管生成的能力。

2.1 MAPK 表皮生長因子受體(EGFR)信號與MAPK通路的激活發(fā)生在49%的骨肉瘤患者中，且信號的激活還與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。Ras是MAPK/ERK的上游信號，同時也是EGFR下游分子。EGFR介導(dǎo)的Ras/Raf/MEK/ERK信號通路被異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和結(jié)局密切相關(guān)[17]。Wang等[18]在骨肉瘤細(xì)胞系MG-63中研究發(fā)現(xiàn)，miR-143不僅能直接結(jié)合K-ras基因3′UTR，而且過表達miR-143能明顯抑制K-ras基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達從而抑制細(xì)胞增殖。此外，共轉(zhuǎn)染K-ras和miR-143部分逆轉(zhuǎn)了miR-143對骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的抑制作用。一項評估m(xù)iR-143在骨肉瘤中作用的研究指出[19]，使用表皮生長因子(EGF)能刺激EGFR的磷酸化并激活基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)導(dǎo)致骨肉瘤侵襲性增加，而miR-143的表達水平無明顯改變。很明顯，EGFR 通路磷酸化抑制劑或細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化抑制劑能阻斷上述過程。當(dāng)過表達miR-143時，MMP-9表達明顯下降，骨肉瘤侵襲性降低，但EGFR的磷酸化水平?jīng)]有明顯降低。這項研究值得注意的是，miR-143可能是通過抑制EGFR信號介導(dǎo)的MAPK/ERK信號路徑抑制骨肉瘤的轉(zhuǎn)移。一項最新的研究顯示[20]，MAPK7是miR-143的靶基因，且骨肉瘤細(xì)胞中miR-143與MAPK7基因表達呈負(fù)相關(guān)，上調(diào)miR-143表達導(dǎo)致MAPK7蛋白表達量明顯下降，骨肉瘤細(xì)胞的生存能力以及轉(zhuǎn)移能力也下降。由此可見，miR-143調(diào)控骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移依賴于MAPK信號通路。

3 miR-143與骨肉瘤凋亡

細(xì)胞凋亡途徑中，內(nèi)源性途徑是由線粒體成分介導(dǎo)，其中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2)蛋白家族受到細(xì)胞內(nèi)信號刺激而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡起到了關(guān)鍵作用。柳豪[21]應(yīng)用熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，miR-143能直接結(jié)合Bcl-2的靶位點，且Bcl-2基因的3′UTR存在兩個靶向結(jié)合位點，分別是Human Bcl-2 3′UTR(1811-1817)和Human Bcl-2 3′UTR(4513-4519)。

3.1 內(nèi)源性凋亡途徑 miR-143的低表達水平與骨肉瘤的發(fā)展和不良預(yù)后有關(guān)[10]。恢復(fù)骨肉瘤細(xì)胞系miR-143的表達能抑制細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞凋亡[15]。這種類似腫瘤抑制作用在許多腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，比如前列腺癌[22]。miR-143的這種作用是通過直接結(jié)合并抑制Bcl-2蛋白表達來實現(xiàn)的，而Bcl-2抗凋亡蛋白在骨肉瘤細(xì)胞中高表達并能促進細(xì)胞生存[15，23]。另外，在骨肉瘤細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-143模擬物后，Bax、Bak和Bad蛋白表達均上調(diào)，caspase-3蛋白表達也增加[15]。由此可見，miR-143促進骨肉瘤細(xì)胞凋亡的機制可能是通過抑制Bcl-2的活性，導(dǎo)致caspase級聯(lián)的激活而實現(xiàn)的。

此外，環(huán)狀RNA-UBAP2(circular RNA-UBAP2，circUBAP2)在骨肉瘤組織樣本和細(xì)胞系中表達均明顯上調(diào)，且過表達的circUBAP2能以“miRNA 海綿”的方式結(jié)合miR-143，從而影響了miR-143對靶基因bcl-2的抑制作用[24]。

4 miR-143與骨肉瘤侵襲及轉(zhuǎn)移

腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個多因素復(fù)雜的過程，其中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)是主要因素之一?；|(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases，MMPs)、尿激酶纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等可參與腫瘤EMT[25]。

4.1 MMPs 在正常生理和病理狀態(tài)下，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)成分并參與組織重塑、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、增殖和血管生成等過程[25]。小鼠骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型和骨肉瘤細(xì)胞系中均發(fā)現(xiàn)MMP-13高表達而miR-143低表達[26]。此外，在骨肉瘤細(xì)胞系中過表達miR-143，MMP-13基因mRNA和蛋白表達水平均降低，細(xì)胞遷移率也明顯下降[27]。Wang等[19]實驗結(jié)果表明，miR-143還能下調(diào)MMP-9基因表達而抑制骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此，miR-143能抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移是較為確切的，但miR-143下調(diào)MMPs表達的直接靶基因卻不清楚。另Liu等[28]在骨肉瘤細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，活化的Cdc42結(jié)合蛋白激酶1(activited Cdc42 kinase 1,ACK1) 3′UTR是miRNA靶向結(jié)合位點，并通過AKT/MMPs通路參與細(xì)胞轉(zhuǎn)移。因此，miR-143在AKT通路中的作用關(guān)系值得探究。

4.2 PAI-1 纖溶酶原激活物抑制因子-1(Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)是uPA成員之一，能夠介導(dǎo)纖維蛋白降解作用從而破壞細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜[25]。Hirahata等[29]對52例人原發(fā)性骨肉瘤樣本進行檢測發(fā)現(xiàn)，PAI-1與MMP-13雙陽性者肺轉(zhuǎn)移率高達53.3%，明顯高于單陽性或雙陰性者。miR-143能直接結(jié)合PAI-1 mRNA 3′UTR而抑制PAI-1蛋白的表達，而PAI-1具有促進骨肉瘤侵襲和肺轉(zhuǎn)移的作用經(jīng)體內(nèi)外實驗證實；同時發(fā)現(xiàn)干擾PAI-1表達后MMP-13表達也明顯下降，骨肉瘤侵襲能力也下降[29]。這提示，uPA不僅能直接降解細(xì)胞外基質(zhì)中的大多數(shù)糖蛋白，還能激活基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)降解膠原蛋白，兩者一起促使腫瘤EMT，共同促進骨肉瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，而miR-143能夠抑制這一過程。

4.3 TGF-β Li等[30]研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤患者中蛋白聚糖(versican，VCAN)表達上調(diào)，且VCAN表達水平與骨肉瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。TGF-β1可上調(diào)VCAN表達促進骨肉瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，這種作用是通過Smad2/3信號抑制miR-143的表達來實現(xiàn)的，而miR-143又能直接結(jié)合VCAN基因3′UTR抑制其蛋白表達。有研究報道，TGF-β和MMPs、uPA三者之間存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系，共同參與了腫瘤的EMT[25]，而miR-143可對它們作用的環(huán)節(jié)實施不同程度的調(diào)控。因此，miR-143對抑制骨肉瘤EMT有重要作用，值得進一步深入研究。

裸鼠體內(nèi)實驗報道[31]，過表達miR-143的骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移裸鼠模型-新鮮肺部組織中GTP 酶激活蛋白(ASAP3)和Musashi 同源物2(MIS2)蛋白的表達量均明顯降低，且通過尾靜脈注射具有肺靶向的miR-143殼聚糖納米球懸液可抑制骨肉瘤向肺部轉(zhuǎn)移；另外miR-143的過表達可導(dǎo)致靶蛋白ASAP3和MSI2在體內(nèi)外的減少。這些結(jié)果提示，miR-143對骨肉瘤侵襲性的抑制可能與ASAP3和MIS2基因表達的下調(diào)有關(guān)，但ASAP3和MIS2過表達是否會增強骨肉瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移能力仍需進一步研究。

5 miR-143與骨肉瘤耐藥

骨肉瘤細(xì)胞的耐藥性與miR-143低表達相關(guān)。在對多柔比星抵抗的骨肉瘤細(xì)胞系中過表達miR-143，可以降低ATG2B及LC3-Ⅱ的表達而增加Bcl-2的表達，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞存活能力下降，進而逆轉(zhuǎn)了化療抵抗[14]。大蒜素能抑制骨肉瘤增殖、轉(zhuǎn)移和與血管生成，同時發(fā)現(xiàn)可上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中miR-143表達[32]。有研究表明[33]，異丙酚的抗骨肉瘤作用部分是通過上調(diào)miR-143表達而抑制MMP-13表達來實現(xiàn)的。低劑量順鉑條件處理MG-63細(xì)胞后，細(xì)胞增殖率降低且miR-143的表達增加[34]?？傊@些數(shù)據(jù)支持了miR-143的腫瘤抑制功能，并建議使用合成的miR-143寡核苷酸或增加miR-143表達的藥物，納入骨肉瘤發(fā)病機制的相關(guān)研究。

6 展望

骨肉瘤的增殖、凋亡以及侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)控與miR-143密切相關(guān)。比如miR-143抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖與其負(fù)向調(diào)控的K-ras、VCAN等基因的表達有關(guān)，而miR-143調(diào)控細(xì)胞凋亡的效應(yīng)與Bcl-2表達水平密切相關(guān)。另miR-143對骨肉瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的影響與下游的MMPs、MAPK、PAI-1等基因的表達水平是分不開的，且它們的表達水平均與miR-143呈負(fù)相關(guān)。但miR-143與骨肉瘤的關(guān)系的研究較少，特別是體內(nèi)實驗更為缺乏。因此，過表達體內(nèi)miR-143的表達對骨肉瘤的作用效果以及miR-143逆轉(zhuǎn)骨肉瘤化療抵抗的效果并不明朗，這有待大量的研究闡明。

在如今的醫(yī)療環(huán)境下，miR-143作為一種新的生物學(xué)標(biāo)志，有著獨特的優(yōu)勢。若能進一步探究具有預(yù)后標(biāo)志物潛能的miR-143與骨肉瘤發(fā)病之間的調(diào)控關(guān)系，那么針對miR-143的調(diào)節(jié)以及針對相應(yīng)靶點的調(diào)節(jié)將會為骨肉瘤的靶向治療開辟新的方向。