王秀娟，何靜，王斌，陳偉，李毅，劉姣姣

(甘肅農(nóng)業(yè)大學林學院，甘肅 蘭州 730070)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim．)屬蕓香科花椒屬植物，為有刺灌木或小喬木，是我國栽培歷史悠久的食用調(diào)料、中藥材、香料、油料、工業(yè)原料等多用途經(jīng)濟樹種[1-2].在山東、山西、河北、河南、陜西、甘肅、四川、湖北、湖南、安徽、云南、貴州等省栽培面積較大，產(chǎn)量高[3].甘肅省隴南地區(qū)栽培的花椒‘大紅袍’以其色澤丹紅，粒大飽滿，油重，純麻可口在省內(nèi)外享有盛譽，是當?shù)厝罕娭赂坏闹еa(chǎn)業(yè)[4].但是，伴隨花椒流膠病的發(fā)生，使正處于掛椒盛期的大紅袍大面積死亡，嚴重影響了廣大椒農(nóng)的生產(chǎn)積極性，制約了花椒生產(chǎn)的產(chǎn)量和質(zhì)量，造成嚴重的經(jīng)濟損失[5-7].

關于此病的研究大多集中于發(fā)病規(guī)律和防治方面.袁忠林發(fā)現(xiàn)導致該病發(fā)生的主要因素是水[5].在病原菌研究方面，我國學者經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，半知菌瘤座孢科的鐮刀菌類(Fusariumsp.)和橘柑褐腐疫霉(Phytophthoracitrophthora)可以造成花椒流膠病的發(fā)生[8-9〗.本試驗對造成花椒流膠病的病原菌進行了分離鑒定，通過致病性試驗，確定了三線鐮孢菌(Fusariumtricinctum)和小穴殼菌屬(Dothiorellasp.)是甘肅隴南地區(qū)花椒流膠病的主要病原，并從病原生物學特性的角度出發(fā)，探究其菌絲生長的最適條件，為科學合理的防治花椒流膠病提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

采自甘肅省隴南市武都區(qū)花椒流膠病典型病株.

1.2 方法

1.2.1 花椒流膠病病原菌的鑒定

1.2.1.1 病原菌的分離和純化 病原菌分離采用常規(guī)組織分離法[10-12]，選取病健交界處組織剪成2～3 mm的小塊，0.1%的升汞消毒30 s，用無菌水沖洗3次，接種在PDA培養(yǎng)基上進行分離培養(yǎng)，每皿按品字形接種3塊，放于25 ℃人工氣候箱中培養(yǎng).后經(jīng)菌種純化，將純培養(yǎng)物于25 ℃恒溫培養(yǎng)，定時觀察菌落形態(tài)，將待鑒定菌種置于0～4 ℃冷藏保存，備用.

1.2.1.2 致病性測定 采用莖皮刺傷接種法[13]，將分離純化所得的病原菌分別接種到大紅袍莖干上.接種前，先將花椒苗木莖干消毒，待表面消毒干凈后，用接種刀在莖干的上、中、下刺傷直徑約為0.5 cm的接種面，在無菌條件下，分別挑取分離所得的不同病原菌菌絲單獨接種在刺傷的接種面上，做好標記.待接種面發(fā)病后，從發(fā)病處再次分離病原菌進行鑒定，并與接種菌進行形態(tài)比較.

1.2.1.3 病原菌的鑒定 形態(tài)學鑒定[14-16]：將分離純化后的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上活化，挑取微量菌絲，制作水浸片在光學顯微鏡下鏡檢.根據(jù)病原菌在PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)性狀、菌落特征、菌絲體的形態(tài)，分生孢子形態(tài)、大小、顏色等相關特征，對病原菌進行形態(tài)學鑒定.

分子生物學鑒定：使用抽提試劑盒：TIANamp Yeast DNA Kit或Plant Genomic DNA Kit嚴格按照說明書進行提取基因組DNA[17].將提取的基因組DNA進行PCR擴增并進行瓊脂糖檢測.PCR擴增采用通用引物ITS1和ITS4，引物序列為：ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)，ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′).由廣州賽哲生物科技股份有限公司進行測序，測序結(jié)果與NCBI已知的序列進行同源性比較，將未知菌鑒定到屬或種.

1.3 病原生物學特性測定

1.3.1 光照對菌落生長的影響 采用全光照、全黑暗和光暗交替(12 h光照，12 h黑暗交替進行)3種光照處理，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)供試病原菌.

1.3.2 pH對菌落生長的影響 設置pH 3，4，5，6，7，8，9，10，11共9組處理，參照李智敏[18]等方法，用濃度均為0.1 mol/L的NaOH和HCl調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的酸堿度.

1.3.3 溫度對菌落生長的影響 設置5，10，15，20，25，30，35，40 ℃共8組溫度處理，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)供試病原菌.

1.3.4 不同培養(yǎng)基對菌落生長的影響 配制 PDA、PSA、玉米粉、燕麥片和牛肉膏蛋白胨共5種培養(yǎng)基[10]，分裝于三角瓶中，高壓滅菌30 min后備用.

1.3.5 病原菌對碳源和氮源的利用 參照陳丹等方法[19]，設置蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、淀粉5種碳源和蛋白胨、硝酸鈉、硝酸銨、牛肉膏4種氮源處理.供試基礎培養(yǎng)基成分為：KH2PO41.08 g，KCl 0.5 g，MgSO20.5 g，生物素 0.5 mg，VB21.5 mg，F(xiàn)eCl3少許，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL.

碳源試驗：基礎培養(yǎng)基中加KNO3作氮源，將供試碳源按20 g/L分別加入基礎培養(yǎng)基中.

氮源試驗：基礎培養(yǎng)基中加葡萄糖(20 g/L)作碳源，將供試氮源按0.277 g/L折算配制，加入基礎培養(yǎng)基.

以上生物學特性試驗采用菌絲生長速率法[20]，將供試菌種打成菌餅，每個菌餅取自4～5 d菌齡大小相同(直徑8 mm)的菌落，將其按品字型接種在各培養(yǎng)基中.每處理重復3次，除溫度處理外，均在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后，用十字交叉法測量菌落直徑.

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0以及Excel 2007進行數(shù)據(jù)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離與致病性測定

從自然發(fā)病的花椒流膠病病樣上共分離出6株

真菌，將分離得到的病原菌依照柯赫氏法則全部回接到正常的大紅袍莖干上，其中4株不具致病性，2株導致了流膠病的發(fā)生.從發(fā)病的接種面上再次分離病原菌，獲得了與接種病原菌相同的病原物.根據(jù)柯赫氏法則，確定這2株接種菌是導致花椒流膠病的主要致病菌.

2.2 病原菌鑒定

形態(tài)學鑒定：待鑒定菌1(圖1)在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d，菌落直徑達75 mm，菌絲叢卷毛狀，培養(yǎng)基底部為粉紅色，生長初期，菌絲白色；之后菌絲中央粉紅色，邊緣白色；隨著生長天數(shù)的增加，中央菌絲變成淡黃色；分生孢子無色，鐮狀至彎曲、紡錘形，經(jīng)形態(tài)學初步鑒定，確定該菌為三線鐮孢菌[21](Fusariumtricinctum)；待鑒定菌2(圖2)在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d，菌落直徑達53 mm，菌絲毛氈狀，培養(yǎng)基底部為棕黑色，生長初期，菌絲白色；之后呈現(xiàn)淡黃色，中央咖啡色；隨著生長天數(shù)的增加，菌絲中間深咖啡色，邊緣白色；分生孢子單生或成鏈狀產(chǎn)生，無色，球形或卵圓形，經(jīng)形態(tài)學初步鑒定，確定該菌為小穴殼菌屬(Dothiorellasp.).

分子生物學鑒定：使用通用引物ITS1/ITS4對菌株rDNA進行PCR擴增，將得到的PCR產(chǎn)物進行3730XL測序，并與NCBI中已知的序列進行同源性比較，結(jié)果顯示，所測菌種的ITS與三線鐮孢菌(Fusariumtricinctum)和小穴殼菌屬(Dothiorellasp.)的序列相似性最高.結(jié)合形態(tài)學鑒定結(jié)果，確定造成花椒流膠病的主要致病菌為三線鐮孢菌(Fusariumtricinctum)和小穴殼菌屬(Dothiorellasp.).

1～2為在PDA平板上正面和反面的菌落形態(tài)；3為光學顯微鏡下分生孢子形態(tài).1～2：The colong morphology on the front and the opposite sides of the PAD plats；3：Conidia morphocogy undur optical microscope.圖1 三線鐮孢菌生物學形態(tài)Figure 1 The morphological characteristics of Fusarium tricinctum

1～2為在PDA平板上正面和反面的菌落形態(tài)；3為光學顯微鏡下分生孢子形態(tài).1～2：The colong morphology on the front and the opposite sides of the PAD plats；3：Conidia morphocogy undur optical microscope.圖2 小穴殼菌屬生物學形態(tài)Figure 2 The morphological characteristics of Dothiorella sp.

2.3 生物學特性

2.3.1 光照對菌落生長的影響 由圖3可以看出，三線鐮孢菌在黑暗條件下最適宜，在光照和光暗交替下菌絲生長差異不顯著；小穴殼菌屬在光暗交替條件下最適宜，在光照和黑暗條件下無顯著差異.

圖3 不同光照條件對病原生長的影響Figure 3 The effect of different light conditions on the growth of the pathogens

2.3.2 pH值對菌落生長的影響 由圖4可知，三線鐮孢菌和小穴殼菌屬對酸堿的適應范圍較廣，在供試pH范圍內(nèi)均可生長.其中，三線鐮孢菌的菌絲生長最適pH值為6～8，且堿性條件優(yōu)于酸性條件，當pH小于6時，生長較慢；小穴殼菌屬的菌絲生長最適pH值為7～9，同樣地，其在堿性條件下的菌絲生長速率明顯高于酸性條件.

2.3.3 溫度對菌落生長的影響 三線鐮孢菌和小穴殼菌屬對溫度的適應范圍較為一致.二者的菌絲生長適宜范圍為 20～30 ℃，25 ℃是其菌絲生長的最適溫度，在5 ℃時受到嚴重抑制，菌絲生長緩慢，當溫度達40 ℃時，菌絲生長停滯(圖5).

圖4 不同pH對病原生長的影響Figure 4 The effect of different pH on the growth of the pathogens

圖5 不同溫度對病原生長的影響Figure 5 The effect of different temperatures on the growth of the pathogens

2.3.4 不同培養(yǎng)基對菌落生長的影響 試驗結(jié)果表明，三線鐮孢菌和小穴殼菌屬在供試5種培養(yǎng)基中均有生長.其中，三線鐮孢菌在PDA培養(yǎng)基中生長最快；PDA和PSA培養(yǎng)基均是小穴殼菌屬的生長較適宜培養(yǎng)基，但在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中小穴殼菌屬生長較慢(圖6).

1:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；2：馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基；3：牛肉膏蛋白胨；4：燕麥片；5：玉米粉.1:PAD mwdium；2：PSA medium；3：Beefpaste peptone medium；4：Oat-meal medium；5：Corn flour medium.圖6 不同培養(yǎng)基對病原生長的影響Figure 6 The effect of different medium on the growth of the pathogens

2.3.5 病原菌對碳源和氮源的利用 試驗表明，三線鐮孢菌和小穴殼菌屬在5種供試碳源物質(zhì)下均可生長，其中，淀粉均是二者的最佳碳源物質(zhì)，但處理間差異各不相同，五種供試碳源物質(zhì)對三線鐮孢菌的生長差異不顯著，而對小穴殼菌屬的生長差異較顯著，小穴殼菌屬在以葡萄糖和麥芽糖為碳源物質(zhì)的條件下生長最差(圖7).在對氮源物質(zhì)的利用中，三線鐮孢菌和小穴殼菌屬表現(xiàn)較為一致，均表現(xiàn)出對硝酸鈉的利用明顯優(yōu)于其他3種氮源物質(zhì)，而在硝酸銨的生長條件下生長最差.

3 討論與結(jié)論

本文結(jié)合形態(tài)學和分子生物學鑒定，明確隴南花椒流膠病的主要病原菌為三線鐮孢菌(Fusariumtricinctum)和小穴殼菌屬(Dothiorellasp.)，就光照、溫度、pH、不同培養(yǎng)基、碳源和氮源的利用對花椒流膠病主要病原菌生物特性進行了研究，為有效防治該病害提供了一定的理論依據(jù).試驗研究表明，三線鐮孢菌在黑暗條件中生長最快，光暗交替次之，全光照下生長最慢，說明光照可抑制三線鐮孢菌菌絲的生長；小穴殼菌屬在光暗交替下生長最快，其它光照條件下不顯著.說明花椒流膠病病菌的發(fā)病與光照有一定的關系，因此良好的光照對防治花椒流膠病有一定的效果，在生產(chǎn)實踐中，做好椒樹的整形修剪對流膠病的防治極為關鍵.三線鐮孢菌和小穴殼菌屬的pH生長范圍均為3～11，兩者皆適合在中性和弱堿性環(huán)境下生長，這與邊小榮[22]三線鐮孢菌最適pH為7的研究結(jié)果基本一致，但與高新明[23]小穴殼菌屬以酸性生長條件較佳的研究結(jié)果相反，這可能與花椒適宜生長在呈弱堿性的土質(zhì)環(huán)境中有關.三線鐮孢菌和小穴殼菌屬的耐受溫度范圍均為5～35 ℃，生長的最適溫度均為25 ℃.這與傅錦婷[24]對山核桃干腐病病原菌小穴殼菌屬的研究結(jié)果基本一致，但與陳慧[25]對馬鈴薯枯萎病病原菌三線鐮孢菌的研究結(jié)果不一致，這可能與分離菌株的部位不同有關.本研究結(jié)果表明，三線鐮孢菌和小穴殼菌屬在所供試的8種培養(yǎng)基上均能生長，其中三線鐮孢菌的最佳培養(yǎng)基為PDA，小穴殼菌屬在PSA培養(yǎng)基上最適合生長.三線鐮孢菌和小穴殼菌屬對營養(yǎng)的需求極其廣泛，適應能力極強.對碳源的要求不高，但對氮源的要求有所不同.試驗研究中發(fā)現(xiàn)，病原可利用單糖形式的葡萄糖和多糖形式的淀粉，但最適宜的碳源為淀粉；可利用蛋白胨中的有機氮和硝酸銨中的無機氮，最適宜的氮源為硝酸鈉.分析其原因，可能與三線鐮孢菌和小穴殼菌屬的寄主、寄主的環(huán)境(溫度、光照、pH值等)因素不同有關，同時，花椒流膠病的發(fā)生往往伴隨著高溫多雨的天氣.結(jié)果表明花椒流膠病病原菌具有碳氮源營養(yǎng)來源廣泛、適宜偏堿環(huán)境生長、耐高溫的特性.本研究明確了花椒流膠病病原菌的生物學特性，可為后期流膠病的田間監(jiān)測、發(fā)病規(guī)律和綜合防治提供科學依據(jù).

碳源：1：葡萄糖；2：麥芽糖；3：乳糖；4：淀粉；5：蔗糖.氮源：1：硝酸鈉；2：硝酸銨；3：牛肉膏；4：蛋白胨.C-sources：1：Glucose;2:Maltose;3:Lactose;4:Starch;5:Sucrose;N-sources:1:Sodium nitrate;2:Ammonium nitrate;3:Beef paste;4:Peptone.圖7 不同碳源和氮源對病原生物的影響Figure 7 Effects of different C-sources and N-sources on the growth of pathogens