陳紅萍 劉開浪 楊宙 何展武 萬鵬 曹豐生 鄧偉

摘要：通過分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合傳統(tǒng)育種技術(shù)進(jìn)行抗稻瘟?。≒yricularia grisea）水稻新品種的選育。以南溪3號(hào)為受體，抗稻瘟病恢復(fù)系R432為供體，經(jīng)過多代輪回選育，培育出米質(zhì)優(yōu)、抗性強(qiáng)、配合力高的早稻恢復(fù)系R677。

關(guān)鍵詞：早稻恢復(fù)系R677;分子標(biāo)記輔助選擇;稻瘟?。≒yricularia grisea）;選育

中圖分類號(hào)：S511? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）02-0029-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.007? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

稻瘟?。≒yricularia grisea）是中國稻類作物重要病害之一，由病原菌（Magnaporthe grisea.）無性世代（Pyricularia grisea）誘發(fā)，在水稻生產(chǎn)上引起減產(chǎn)等毀滅性的災(zāi)難[1-3]。這對(duì)于全世界水稻育種家選育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的優(yōu)良品種具有挑戰(zhàn)性。在中國丘陵山區(qū)地帶，水稻稻瘟病發(fā)病率很高，其主要影響水稻產(chǎn)量，一般造成產(chǎn)量損失在10%～30%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)達(dá)到40%～50%，甚至存在顆粒無收的情況;其次對(duì)水稻米質(zhì)也影響很大[4-8]。選育抗病性強(qiáng)的優(yōu)良品種是保證水稻高產(chǎn)的有效措施。多年來，國家及地方水稻新品種審定委員會(huì)把抗稻瘟病這一項(xiàng)評(píng)審標(biāo)準(zhǔn)納入其內(nèi)，充分證明稻瘟病對(duì)水稻生產(chǎn)的危害性，并進(jìn)一步證實(shí)了國家對(duì)抗稻瘟病品種的重視程度[9-12]。隨著社會(huì)科技的進(jìn)步，分子生物技術(shù)已經(jīng)深入應(yīng)用到育種科研工作中，也是作物傳統(tǒng)育種方法的一個(gè)巨大轉(zhuǎn)變，可以高效、快速、精準(zhǔn)選育出高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、抗病性強(qiáng)的優(yōu)良品種。

迄今為止，世界各地的育種家和植物病理學(xué)家利用分子生物技術(shù)已發(fā)掘出了超過100個(gè)抗稻瘟病的基因[10，13-15]，分別鎖定在3、4、5、6、7、8、11、12號(hào)染色體上，其中已成功克隆了25個(gè)廣譜抗稻瘟病的基因，如Pi1、Pi2、Pi9、Pi25、Pia、Pik、Pigm等;但大多數(shù)抗病持久性不理想[16-20]。對(duì)稻瘟病持久性抗病的問題一直受到水稻育種家的重視和關(guān)注，也是水稻育種改良項(xiàng)目的棘手問題。

本研究以抗稻瘟病恢復(fù)系R432為供體，南溪3號(hào)為受體，通過分子標(biāo)記輔助育種選擇（Marker assisted selection，MAS）將抗病、高產(chǎn)等優(yōu)質(zhì)基因?qū)胧荏w親本中，利用稻瘟病自然誘發(fā)的方法培育抗稻瘟病強(qiáng)、恢復(fù)度高、米質(zhì)優(yōu)的新恢復(fù)系，以期進(jìn)一步提高其配組雜交組合的優(yōu)勢(shì)，為新品種選育提出參考。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

以南溪3號(hào)為受體，抗稻瘟病恢復(fù)系R432為供體，通過多世代回交選育抗性稻瘟病的強(qiáng)恢復(fù)系。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? R677的選育和恢復(fù)系鑒定方法? 2011年配組雜交，當(dāng)年翻秋加代，在海南省冬繁加代，通過多代回交和自交選育，從回交BC2F1到BC3F5進(jìn)行抗病株檢測(cè)并結(jié)合常規(guī)育種，在井岡山稻瘟病自然誘發(fā)區(qū)進(jìn)行鑒定和篩選，選出了優(yōu)良的理想單株。BC3F5代開始測(cè)恢，與野敗不育系大量測(cè)交，篩選出強(qiáng)恢復(fù)系代號(hào)M11677，簡(jiǎn)稱為R677。該恢復(fù)系中抗稻瘟病、株型理想、恢復(fù)力強(qiáng)。

1.2.2? 分子標(biāo)記輔助選擇? 在分離后代回交2代（BC2F1）三葉期采取葉片，并利用CTAB法提取DNA[21]。鑒定抗稻瘟病基因Pi1的分子標(biāo)記為RM224（F，5′-ATCGATCGATCTTCACGAGG-3′;R，5′-TGCTATAA

AAGGCATTCGGGG-3′），鑒定抗稻瘟病基因Pi2的分子標(biāo)記為AP22（F，5′-GTGCATGAGTCCAGCTCA

AA-3′;R，5′-GTGTACTCCCATGGCTGCTC-3′）。

PCR反應(yīng)體系（15 μL）：DNA 2 μL，ddH2O 8 μL，dNTPs （10 mmol/L） 0.3 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1.5 μL，10×PCR Buffer 1.5 μL和Taq DNA聚合酶0.2 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共37個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。最后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物（PCR）用8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。同時(shí)，對(duì)供試品種進(jìn)行稻瘟病誘發(fā)區(qū)鑒定與驗(yàn)證。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 分子檢測(cè)抗稻瘟病基因?qū)氲慕Y(jié)果

采取水稻樣本幼苗葉片，用含有Pi1、Pi2抗稻瘟病基因的分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。Pi1和Pi2的陽性對(duì)照為R432，陰性對(duì)照為南溪3號(hào)。22個(gè)選育后代樣本檢測(cè)結(jié)果為例，第10泳道Pi1和Pi2雙陽性導(dǎo)入的樣本為本研究的篩選單株，可用于后期的稻瘟抗性和育種評(píng)估。

2.2? R677恢復(fù)系的特征特性

R667恢復(fù)系是野敗型恢復(fù)系，屬于早秈類型，正季播種至始穗期86 d，恢復(fù)度高，與雄性不育系測(cè)交，結(jié)實(shí)率85%以上，具有較強(qiáng)的配組優(yōu)勢(shì)，株高110.5 cm，穗長(zhǎng)24.6 cm，每穗粒數(shù)132.1粒，千粒重25.2 g，分蘗較好，米質(zhì)一般。

2.3? 欣榮優(yōu)677組合主要農(nóng)藝性狀

利用新選育成的恢復(fù)系R677與欣榮A測(cè)交配組，篩選出強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合欣榮優(yōu)667，全生育期113.1 d，比對(duì)照榮優(yōu)463早0.7 d，株高92 cm，穗長(zhǎng)約21.5 cm，每穗穎花115～140粒，每公頃有效穗387萬，成穗率70.5%，每穗總粒數(shù)122.1粒，每穗實(shí)粒數(shù)109.8粒，千粒重26.6 g，結(jié)實(shí)率88.4%，分蘗力較強(qiáng)，株型適中，葉色濃綠，長(zhǎng)勢(shì)旺，后期轉(zhuǎn)色好，抗倒，不易早衰。

2.4? 欣榮優(yōu)677的稻米品質(zhì)

經(jīng)農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心檢測(cè)，欣榮優(yōu)677出糙率80.7%，整精米率63.3%，精米率70.3%，粒長(zhǎng)6.2 mm，粒型長(zhǎng)寬比2.8，堊白度5.8%，堊白粒率13%，膠稠度78 mm，直鏈淀粉含量12.0%，堿消值4.0，水分12.9%，透明度1級(jí)。

2.5? 欣榮優(yōu)677的抗性表現(xiàn)

以榮優(yōu)463為對(duì)照，分別在江西省井岡山、婺源縣、宜豐縣稻瘟病自然誘發(fā)鑒定區(qū)進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定。結(jié)果如表1所示，欣榮優(yōu)677穗頸瘟為3級(jí)，中抗稻瘟病。

2.6? 欣榮優(yōu)677組合優(yōu)勢(shì)的評(píng)價(jià)

R677為早稻新恢復(fù)系，與多個(gè)不育系測(cè)交，雜交一代表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)強(qiáng)，產(chǎn)量高，米質(zhì)優(yōu)，抗病性強(qiáng)。欣榮優(yōu)677組合的每公頃平均產(chǎn)量為755.3 kg，比對(duì)照榮優(yōu)463增產(chǎn)1.95%，與對(duì)照產(chǎn)量差異不明顯，但是欣榮優(yōu)677組合抗稻瘟病，品質(zhì)優(yōu)，展現(xiàn)出良好的推廣應(yīng)用潛力。

3? 討論

選育配合力高、抗稻瘟病、品質(zhì)優(yōu)良的新恢復(fù)系，借助分子標(biāo)記輔助育種與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合的方法，可提高育種效率，減少盲目性，能夠快速、有效、精準(zhǔn)地選育出帶有目標(biāo)性狀的強(qiáng)優(yōu)勢(shì)恢復(fù)系，又加快了抗病性基因育種的選育進(jìn)程。本研究培育了1個(gè)中抗稻瘟病、米質(zhì)優(yōu)、一般配合力高的恢復(fù)系R677，并建立了一套完善的利用分子標(biāo)記輔助選擇與稻瘟病自然誘發(fā)相結(jié)合的育種體系。

參考文獻(xiàn)：

[1] BAKER B，ZAMBRYSKI P，STASKAWICZ B，et al. Signaling in plant-microbe interactions[J].Science，1997，276（5313）：726-733.

[2] 蘆? 慧，涂曉嶸，徐? 佳，等.抗真菌單體組分DZP8對(duì)水稻紋枯病菌和稻瘟病菌的抗菌作用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（3）：96-100.

[3] 徐未未，王? 興，黃永相，等.水稻抗稻瘟病基因的分子標(biāo)記與標(biāo)記輔助育種研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（4）：898-906.

[4] 張? 磊，張啟軍，程兆榜，等.4套水稻稻瘟病鑒別品種對(duì)江蘇地區(qū)主要稻瘟病菌株的抗性分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，26（5）：948-953.

[5] 周光召.面向21世紀(jì)的科技進(jìn)步與社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展[M].北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，1999.522.

[6] 孫國昌，杜新法，陶榮祥，等.水稻稻瘟病防治策略和21世紀(jì)研究展望[J].植物病理學(xué)報(bào)，1998，28（4）：289-292.

[7] 孫國昌，杜新法，陶榮祥，等.水稻稻瘟病防治研究進(jìn)展和21世紀(jì)初研究設(shè)想[J].植物保護(hù)，2000，26（1）：33-35.

[8] 劉國權(quán)，孟昭河，任艷軍，等.水稻抗稻瘟病研究進(jìn)展與對(duì)策[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2004，20（1）：211-214.

[9] 呂學(xué)蓮，白海波，惠? 建，等.利用廣譜抗病基因Pigm改良水稻稻瘟病抗性的研究[J].分子植物育種，2017，15（11）：4336-4342.

[10] 闞虎飛，田大剛，魯國東，等.稻瘟病基礎(chǔ)抗性機(jī)制的研究進(jìn)展[J].分子植物育種，2017，15（4）：1541-1547.

[11] 何秀英，劉新瓊，王? 麗，等.稻瘟病新隱性抗病基因pi55（t）的遺傳及定位[J].中國科學(xué)：（生命科學(xué)），2012，42（2）：125-134.

[12] 李? 彬，鄧元寶，顏學(xué)海，等.一個(gè)粳稻來源抗稻瘟病基因的鑒定、遺傳分析和基因定位[J].作物學(xué)報(bào)，2014，40（1）：54-62.

[13] 王? 玲，左示敏，張亞芳，等.四川省稻瘟病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[J].中國水稻科學(xué)，2015，29（3）：327-334.

[14] OKUYAMA Y，KANZAKI H，ABE A，et al. A multifaceted genomics approach allows the isolation of the rice Pia-blast resistance gene consisting of two adjacent NBS-LRR protein genes[J].The Plant Journal，2011，66（3）：467-479.

[15] LEE S K，SONG M Y，SEO Y S，et al. Rice Pi5-mediated resistance to Magnaporthe oryzae requires the presence of two coiled-coil-nucleotide-binding-leucine-rich repeat genes[J].Genetics，2009，181（4）：1627-1638.

[16] HUA L X，WU J Z，CHEN C X，et al. The isolation of Pi1，an allele at the Pik locus which confers broad spectrum resistance to rice blast[J].Theoretical and Applied Genetics，2012，125（5）：1047-1055.

[17] ZHOU B，QU S，LIU G，et al. The eight amino-acid differences within three leucine-rich repeats between Pi2 and Piz-t resistance proteins determine the resistance specificity to Magnaporthe grisea[J].Molecular Plant-microbe Interactions，2006， 19（11）：1216-1228.

[18] DENG Y W，ZHU X D，SHEN Y，et al. Genetic characterization and fine mapping of the blast resistance locus Pigm（t） tightly linked to Pi2 and Pi9 in a broad-spectrum resistant Chinese variety[J].Theoretical and Applied Genetics，2006，113（4）：705-713.

[19] ZHAI C，LIN F，DONG Z，et al. The isolation and characterization of Pik，a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication[J].New Phytologist，2011，189（1）：321-334.

[20] 于海燕，趙? 兵，徐環(huán)宇，等.水稻稻瘟病的發(fā)生與防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012（24）：148-149.

[21] 王? 珍，方宣鈞.植物DNA分離[J].分子植物育種，2003，15（2）：281-288.