陳臻浩(綜述) 趙廣雷 石晶晟 蔣 勵 夏 軍(審校)

(復(fù)旦大學附屬華山醫(yī)院骨科 上海 200040)

軟骨是脊椎動物獨特和重要的組織。在青少年期,軟骨組織作為軟骨內(nèi)成骨的模板不斷生成骨組織;在成年期,軟骨組織主要留在關(guān)節(jié)內(nèi),形成骨骼的關(guān)節(jié)。關(guān)節(jié)軟骨是由軟骨細胞、纖維和基質(zhì)構(gòu)成的略帶彈性的堅韌組織,起到支持、保護和緩沖作用。很多關(guān)節(jié)疾病都是由于軟骨損傷所造成,如半月板損傷、退行性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)增生、腰椎間盤突出等。想要對這些疾病進行更深入的理解和探究,需要進一步澄清軟骨細胞分化和基質(zhì)產(chǎn)生的分子機制。Y染色體性別決定區(qū)(sex-determing region of Y chromosome,SRY)-盒轉(zhuǎn)錄因子9(SRY-box transcription factor 9,Sox9)在軟骨細胞分化調(diào)節(jié)中極為關(guān)鍵[1-3],參與軟骨多個分化階段的調(diào)控。本文對近20年來Sox9調(diào)控軟骨發(fā)育的研究進行綜述。

Sox9在軟骨分化中的作用Sox9最早于1993年在一種性別反轉(zhuǎn)畸形疾病(campomelic dysplasia,CD)的研究中被發(fā)現(xiàn),CD綜合征是一種先天性可致死性軟骨發(fā)育異常綜合征[4]。Sox9基因是位于Y染色體上SRY基因的同源基因(17q24.3～q25.1),其編碼產(chǎn)物有509個氨基酸多肽[5-6],是一種與軟骨形成、性別分化、神經(jīng)系統(tǒng)以及心臟發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。Wagner等[7]和Foster等[8]證實,人類骨骼形態(tài)異常綜合征及軀干發(fā)育異常是由于Sox9基因內(nèi)和基因周圍的雜合突變造成的。這種常染色體顯性疾病在圍產(chǎn)期常導致胎兒呼吸窘迫而死亡,即使出生,患者常常伴隨不成比例的身材矮小、四肢鞠躬、低位耳朵、鼻梁凹陷、馬蹄內(nèi)翻足、長人中和小頜畸形等臨床特征。除了骨骼缺陷之外,這種疾病常伴有XY性反轉(zhuǎn)和心臟等內(nèi)臟器官的畸形。這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了后續(xù)研究,以探究Sox9在骨骼發(fā)生和其他組織發(fā)育過程中的作用。

Sox9是調(diào)控軟骨分化的主要基因多項研究表明Sox9是激活軟骨細胞的特異性因子,因此提出了Sox9是軟骨形成的主要調(diào)節(jié)因子,是軟骨形成所必需的。Sox9雜合子缺失的小鼠幾乎完全復(fù)制了人類軀干發(fā)育異常的骨骼異常,并且像許多相同突變的患者一樣,Sox9雜合子缺失的小鼠在出生后不久就死亡[9]。Bi等[10]構(gòu)造了含Sox9胚胎干細胞,并用來產(chǎn)生小鼠胚胎嵌合體,在這些含Sox9胚胎干細胞中用LacZ取代了Sox9編碼序列,以便追蹤表達Sox9無效等位基因的突變細胞。研究發(fā)現(xiàn),在中期胚胎嵌合體的所有骨骼發(fā)育間充質(zhì)中,這些細胞與野生型細胞相混合,但在晚期階段這些細胞沒有出現(xiàn)在軟骨前體細胞聚集過程和軟骨原基內(nèi)。即便一些細胞簇靠近軟骨原基,也不能表達軟骨標記,如Col2a1、Col11a2和Agc1。Akiyama等[3]在骨骼發(fā)生早期使用噬菌體P1的Cre重組酶/loxP重組系統(tǒng)在骨骼發(fā)生的早期階段滅活了小鼠的Sox9基因,發(fā)現(xiàn)在軟骨前體細胞聚集之前,肢芽間質(zhì)中Sox9的失活會導致間充質(zhì)細胞聚集異常以及隨后的軟骨和骨形成阻礙。Sox9可以通過上調(diào)細胞骨架組裝基因、同型細胞間黏附和對異型細胞排斥的基因(如Sema3c和Sema3d)來確保軟骨前細胞的凝聚和存活[11]。這些研究充分證實Sox9在軟骨細胞分化過程中不可或缺。

除了Sox9,Sox5和Sox6基因在軟骨細胞分化過程中也起到重要的作用。Smits等[12]和Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn),Sox5和Sox6雙無效小鼠易發(fā)展成嚴重、廣泛的軟骨發(fā)育不全,而Sox5無效或Sox6無效的小鼠出生時只存在輕微骨骼受損。在Sox5和Sox6雙突變體中,即使Sox9表達正常,軟骨細胞也在軟骨前細胞聚集階段被阻滯。新的研究發(fā)現(xiàn)Sox6在軟骨形成-骨生成的協(xié)調(diào)中發(fā)揮重要作用。以上小鼠的功能喪失和獲得性實驗證明,Sox9、Sox5和Sox6形成的轉(zhuǎn)錄因子三重組在軟骨形成中起決定性作用[10,13-14]。

Sox9不僅是有效的轉(zhuǎn)錄激活因子,還可抑制非必需基因,如Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)基因。然而,這些發(fā)現(xiàn)仍然存在疑問:迄今為止進行的ChIP-seq研究發(fā)現(xiàn)Sox9與活性增強劑和啟動子強結(jié)合,而不與轉(zhuǎn)錄抑制標記的基因組區(qū)域結(jié)合,因此可能是間接機制,例如Sox9激活轉(zhuǎn)錄抑制因子。另一種轉(zhuǎn)錄活性假說是:在軟骨細胞中,Sox9是先驅(qū)因子,即一種結(jié)合濃縮染色質(zhì)的因子,并在軟骨細胞分化時誘導軟骨特異性基因活化所必需的表觀遺傳修飾[15]。要證明Sox9是決定和維持軟骨細胞譜系命運的軟骨源性先驅(qū)因子,還需要更多的數(shù)據(jù)支持。

Sox9依賴的轉(zhuǎn)錄機制Sox9通過抑制Runx2和β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性來促進軟骨細胞分化。在軟骨內(nèi)骨化發(fā)生時,軟骨細胞來自與成骨細胞相同的間充質(zhì)祖細胞。這些被稱為骨軟骨祖細胞的細胞具有雙相性,可表達Sox9、Runx2和β-連環(huán)蛋白。Runx2是決定成骨細胞命運和早期分化的轉(zhuǎn)錄因子[13]。β-連環(huán)蛋白是Wnt經(jīng)典途徑的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)導子,其蛋白質(zhì)水平在成骨前體細胞中上調(diào),在軟骨前體細胞中下調(diào)。在骨軟骨祖細胞中β-連環(huán)蛋白能促進成骨細胞分化并抑制成軟骨細胞分化[16]。Sox9與β-連環(huán)蛋白結(jié)合并抑制β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性,部分是通過誘導β-連環(huán)蛋白的降解[17]。Sox9對Runx2發(fā)揮顯著的抑制作用,可能通過泛素介導蛋白酶體依賴途徑磷酸化依賴途徑,或通過溶酶體來促進Runx2降解[18],其中SCF家族E3泛素連接酶(E3 ubiquitin protein ligase,Skp2)通過蛋白酶體途徑介導Runx2降解。

p300、Smad3、ZNF606、KLF15和DDRGK1等輔助因子可能與Sox9組裝成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物[19-23]。這些因子直接或間接與Sox9結(jié)合,在軟骨細胞特異性基因上招募Sox9,并與Sox9配合激活轉(zhuǎn)錄。他們的基因喪失突變可以引起軟骨發(fā)育不良。Tan等[24]和He等[25]通過體內(nèi)外實驗證實,GLI因子作為介導Hedgehog信號傳遞的鋅指蛋白,在增殖和肥大前軟骨細胞中與Sox9有功能上的相互作用;在向肥大過渡的過程中,JUN和FOSL2形成的激活蛋白1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與Sox9相互作用;Sox9與FOXA2(forkhead box A2)因子之間的競爭可能在調(diào)節(jié)包括Col10a1在內(nèi)的肥大標記物中起決定作用。Scleraxis(Scx)是組織特異性堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)肌腱和韌帶祖細胞的分化。Col2a1的表達受Sox9和Scx的適當轉(zhuǎn)導刺激。Scx與其他bHLH蛋白二聚化的配偶體E47協(xié)同增強Sox9依賴性轉(zhuǎn)錄。共激活物(p300)在Scx和E47協(xié)同作用下,增加Sox9調(diào)節(jié)的軟骨標志基因活性,免疫共沉淀分析顯示Scx和E47與Sox9和p300形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。這些結(jié)果表明,Scx和E47可能通過與Sox9相關(guān)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合,并通過與Col2a1啟動子上保守的E盒序列相結(jié)合,來調(diào)節(jié)初期軟骨形成[26]。

Sox9還招募介體復(fù)合體,并將其與轉(zhuǎn)錄起始位點RNA聚合酶Ⅱ周圍的一般轉(zhuǎn)錄裝置連接起來。Nakamura等[27]證明Sox9、Wwp2和Med25相互作用,他們是中間介導復(fù)合體的組成部分,是軟骨形成中各種因子相互作用的基礎(chǔ)。Matrilin-1(Matn1)為軟骨基質(zhì)蛋白,屬于多結(jié)構(gòu)域銜接蛋白家族,它通過形成膠原依賴和不依賴的細絲并與聚集蛋白聚糖相互作用來促進軟骨基質(zhì)的組裝。為揭示軟骨特異性基因在生長板中交錯表達的機制,Nagy等[28]剖析了驅(qū)動Matn1基因表達的轉(zhuǎn)錄機制。在Matn1近端啟動子進化保守的順式作用元件限制生長板增殖區(qū)和前肥大區(qū)的軟骨表達。近端元件包括與Sox三重組結(jié)合的Pe1元件、結(jié)合Nfi蛋白的SI元件和結(jié)合Sox三重組及其他因子的啟動子Ine元件。Sox5/Sox6與Ine相結(jié)合以及Nfi與SI相結(jié)合通過蛋白質(zhì)劑量依賴性方式調(diào)節(jié)Sox9反式激活。結(jié)果表明,Sox招募介體復(fù)合體與保守的Matn1近端元件結(jié)合并且彼此相互作用,從而在軟骨生長板的特定區(qū)域中微調(diào)基因表達。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)[29],在早期軟骨形成中高遷移率族1(high mobility group box 1,Hmgb1)過表達增加了Sox三重組引起的Matn1啟動子激活,且在COS-7細胞中Hmgb1大量表達促進了Sox三重組誘導的Matn1表達。由此證明,Hmgb1有助于Sox三重組募集到Matn1啟動子并促進早期軟骨發(fā)生。

Sox9被確定為軟骨形成主要基因之后,大量研究進一步揭示Sox9在軟骨形成中的具體機制。研究顯示Sox9蛋白的翻譯后修飾,包括磷酸化,乙?；蚐UMO化,在軟骨形成中影響Sox9依賴性轉(zhuǎn)錄。 Rho激酶與Sox9相互作用并直接在絲氨酸181處磷酸化[30],而轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)增加Sox9絲氨酸211處磷酸化[31]。這種修飾引起了Sox9的核積累,提高了Sox9與DNA結(jié)合的效率,增加了轉(zhuǎn)錄活性。Sox9蛋白也被活化的STAT1蛋白抑制劑(protein inhibitor of activated STAT 1,PIAS1)修飾,但PIAS1是抑制還是刺激Sox9活性尚不清楚[32],需要進一步研究來闡明Sox9翻譯后修飾的功能性結(jié)果。

這幾種Sox蛋白在軟骨形成的多個步驟中都是必需的。Sox9維持從祖細胞到肥大軟骨細胞的過程,它與Sox5/Sox6有效地促進軟骨細胞分化,并在生長板軟骨細胞成熟過程中與不同的轉(zhuǎn)錄因子相互作用。

Sox9相關(guān)的表觀遺傳學調(diào)控表觀遺傳學被定義為不涉及根本的DNA信息變化的可遺傳基因調(diào)節(jié)。表觀遺傳也是成軟骨分化的主要調(diào)控機制之一,在決定其分化方向上起到重要作用。表觀遺傳調(diào)控包括DNA甲基化、組蛋白修飾、微小RNA調(diào)控和染色質(zhì)重塑等[33]。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶分析顯示,包含多個Sox9結(jié)合序列的染色質(zhì)化DNA模板的組蛋白乙?；赟ox9和p300存在下被激活。E74樣因子3(E74 like ETS transcription factor 3,ELF3)通過抑制Sox9-CBP/p300驅(qū)動的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性來調(diào)節(jié)軟骨細胞中Sox9表達,從而影響軟骨細胞基質(zhì)的產(chǎn)生[34]。該研究表明Sox9相關(guān)的共激活物p300在軟骨發(fā)生的表觀遺傳學中是必需的。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)是TGF-β超家族成員之一,通過增強核因子Y(nuclear factor Y,NF-Y)-p300復(fù)合物與Sox9啟動子之間的相互作用來刺激Sox9的表達。BMP2還能在染色質(zhì)的Sox9基因上誘導組蛋白高乙?；痆35]。

KDM4B是含有組蛋白脫甲基酶的Jumonji-C結(jié)構(gòu)域,可選擇性使H3K9me3脫甲基至H3K9me1,同時保持H3K9me2不變[36]。TGF-β誘導的KDM4B從Sox9基因啟動子中除去H3K9me3,從而促進Smad2/3結(jié)合到Sox9基因啟動子[37]。Hata等[38]將AT豐富的交互區(qū)5b(AT rich interactive domain 5B,Arid5b)識別為Sox9的轉(zhuǎn)錄共同調(diào)控因子。Arid5b將組蛋白賴氨酸脫甲基酶募集到Sox9靶基因的啟動子區(qū)域,并刺激這些基因的H3K9me2去甲基化來促進軟骨細胞分化。

微小RNA(microRNA)是一類長度為21～25 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA,可通過堿基互補配對的方式與靶mRNA特異結(jié)合,剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或抑制其翻譯。miRNA-449a對淋巴增強結(jié)合因子1具有直接抑制作用,進而抑制Sox9的表達量[39]。Thompson等[40]發(fā)現(xiàn)一種小分子GTP酶(RAS like proto-oncogene A,RALA)是miR-140-5p的新靶點,在成軟骨分化的早期抑制RALA可以導致Sox9表達明顯上調(diào)。Sox9基因的3’非編碼區(qū)存在miR-495的結(jié)合位點[41],miR-495能直接結(jié)合到該位點對Sox9進行負性調(diào)節(jié)。過度表達miR-495抑制Sox9和軟骨特異性細胞外基質(zhì)表達,如Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖和蛋白多糖產(chǎn)物等。Mak等[42]報道了miRNA-145在人軟骨肉瘤細胞中表達。miRNA-145與Sox9 RNA的結(jié)合可降低Sox9蛋白水平。Wa等[43]通過miRNA陣列分析篩選出miR-30b是TGF-β3誘導的胚胎干細胞成軟骨分化的關(guān)鍵負調(diào)控因子,其直接靶向Sox9而起作用。這些研究部分闡明了Sox9在軟骨形成中的表觀遺傳學機制。

結(jié)語Sox9在決定軟骨細胞的命運和分化中起著重要作用,多種因子參與Sox9的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物形成。目前對Sox9與這些因子相互作用的方式和關(guān)系仍有很多未知,Sox9在軟骨發(fā)生過程中的作用譜尚未得到完整解答。Sox9在成為轉(zhuǎn)錄激活劑之前是否是一個先驅(qū)因子,它能直接抑制相關(guān)基因嗎？有關(guān)Sox9轉(zhuǎn)錄和翻譯后調(diào)控及其對軟骨發(fā)生的影響等問題同樣沒有得到解答。通過CRISPR/Cas介導的基因組編輯等先進技術(shù)進一步研究這些問題,對揭示軟骨發(fā)育分子機制有重要作用,并可為軟骨退行性疾病中組織再生提供新策略。