張克英 ，陳啟亮 ，芮剛 ，武霄錚 ，郭玲 ，張俊平 ，劉志強 ，李和平 ，丁桂榮

1.空軍軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學系輻射防護醫(yī)學教研室，陜西西安710032；2.空軍軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學院三大隊二中隊，陜西西安710032；3.中國人民解放軍78506部隊，四川成都610000；4.華北理工大學機械工程學院，河北唐山063210；5.清華大學工程物理系，北京100084；6.特殊作業(yè)環(huán)境危害評估與防治教育部重點實驗室，陜西西安710032

前言

等離子體通常是一種離子化的氣體狀物質(zhì)，被認為是獨立于固、液、氣之外的物質(zhì)第四態(tài)，按照粒子的溫度可將等離子體分為兩大類，熱平衡等離子體（或熱等離子體）和非熱平衡等離子體（或冷等離子體）［1］。其中，熱等離子體具有較高的能量密度，粒子溫度可達10 000-20 000 K的數(shù)量級，故被廣泛用于銅、鋁、鈦、鎳等金屬材料的高溫熔煉［2］，非金屬材料的熱熔化和納米材料的制備等；而冷等離子體則被用于材料表面改性、清潔活化、高效滅菌和加速化學反應等。

出血作為最常見的創(chuàng)傷表現(xiàn)形式，是創(chuàng)傷早期患者死亡的主要原因之一［3］。內(nèi)臟出血、腔道出血等隱匿性出血，目前多采用介入手術(shù)栓塞血管、出血點套扎等方式，手術(shù)難度較大。既往研究顯示，熱等離子體可以通過熱效應使蛋白變性和血液干燥從而達到凝血的目的［4］，但熱等離子體在發(fā)揮凝血作用的同時可引發(fā)出血部位的灼痛感，甚至造成周圍組織的燒傷和傷口的延遲愈合［5］。據(jù)報道，大氣壓冷等離子體（Cold Atmospheric Plasma,CAP）可以加速血液凝固并促進傷口愈合，且不會對周圍組織造成損傷，該研究結(jié)果為出血性疾病治療提供了新的方法和思路［6-7］。本研究從體外血滴實驗不同參數(shù)CAP對凝血效果的影響以及動物出血模型兩個方面展開CAP促凝血現(xiàn)象的驗證，并通過抗凝血滴對其機制進行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級成年雄性SD大鼠22只，體質(zhì)量（250±20）g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。大鼠隨機分為空白對照組（n=11）和CAP處理組（n=11）。動物飼養(yǎng)在22～24℃的恒溫環(huán)境中，濕度保持在40%～70%，保證12 h/d的光照并避免噪音，飼養(yǎng)期間所有動物可自由攝取水和食物。所有實驗均獲得第四軍醫(yī)大學倫理委員會批準。

1.2 CAP裝置

本實驗采用的CAP裝置由清華大學工程物理系研制，該裝置以氦氣作為氣體源，采用介質(zhì)阻擋放電方式產(chǎn)生CAP射流，其中含有OH、N2、He、O、NO、N2+等活性離子。

1.3 血滴實驗

大鼠用1%戊巴比妥鈉（0.45 mg/kg）腹腔注射麻醉，在距大鼠尾部末端約2 mm處剪斷其尾巴，然后立即用無菌離心管收集血液并吸取100μL血液滴于載玻片中央。將制備好的血滴玻片隨機分為Control組（n=3）和CAP處理組（n=3）。CAP處理組立即采用不同作用距離（1、2、3 cm），不同放電電壓（3.33、6.73、8.03 kV）和不同作用時間（30、60、120 s）的CAP處理血滴。Control組暴露于空氣中不做任何處理。血液滴于玻片5 min時采集血滴圖片，分析血滴凝固效果。

1.4 出血模型實驗

1.4.1 尾部出血模型將大鼠按照上述方法麻醉，在距大鼠尾部末端約5 mm處剪斷尾巴建立此出血模型［8］，之后立即采用正常血滴實驗篩選的CAP最佳凝血參數(shù)（放電電壓8.03 kV、照射時間120 s、照射距離1 cm）處理出血部位，通過記錄出血時間和出血量（濾紙吸收血液后濕重-濾紙干重）評價CAP的凝血效果［9］。Control組暴露于空氣中不做任何處理。

1.4.2 腳趾出血模型在距大鼠左前足最外側(cè)腳趾末端約1 mm處剪斷腳趾建立此出血模型。之后，采用與尾部出血模型相同的CAP參數(shù)研究其對大鼠腳趾出血的干預效果。

1.4.3 股靜脈出血模型將大鼠仰臥位固定于無菌操作臺上，剔除大鼠左側(cè)腹股溝毛發(fā)，碘伏消毒皮膚后暴露并分離股靜脈，用6號針頭45°穿刺股靜脈，建立股靜脈出血模型［10］。采用與尾部出血模型相同的方式觀察CAP對大鼠股靜脈出血的干預效果。

1.5 抗凝血滴實驗

將大鼠用1%戊巴比妥鈉（0.45 mg/kg）腹腔注射麻醉，之后做“U型”皮膚切口，剪斷肋骨并充分暴露心臟，利用無菌注射器于左心室抽取6 mL血液，并用枸櫞酸鈉對抽取的血液作抗凝處理。吸取抗凝血100μL滴于載玻片中央，采用放電電壓8.03 kV、處理時間120 s和作用距離為1 cm的CAP處理血滴。Control組暴露于空氣中不做任何處理。血液滴于玻片5 min時采集血滴圖片，并分析血滴凝固效果。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，出血時間、出血量采用單因素方差分析進行組間比較，P＜0.05認為結(jié)果有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 CAP促進血滴凝固的距離效應

不同CAP作用距離結(jié)果顯示，Control組血滴表面形態(tài)未發(fā)生明顯變化（圖1a）。與對照組相比，當放電電壓為8.03 kV，處理時間為120 s，作用距離為1 cm時，CAP處理組血滴表面變得干燥且有殼樣物形成，其表面可見酒窩樣凹陷（圖1b）；當放電電壓和處理時間不變，作用距離增加至2 cm時，CAP組血滴表面干燥程度顯著降低，凹陷數(shù)量明顯減少（圖1c）；當作用距離增加至3 cm時，可見CAP組僅血滴周圍有輕度凝固，血滴表面未見明顯凹陷（圖1d）。上述結(jié)果提示，CAP具有明顯促進血滴凝固的作用，并且與CAP作用距離呈負相關(guān)。

圖1 CAP促進正常血滴凝固的距離效應Fig.1 Effect of treatment distance of cold atmospheric plasma(CAP)on blood coagulation

2.2 CAP促進血滴凝固的時間效應

Control組血滴暴露于空氣中5 min后其表面形態(tài)幾乎沒有變化，中央?yún)^(qū)依然光滑透亮（圖2a）。與對照組相比，當放電電壓為8.03 kV，作用距離為1 cm，處理時間為30 s時，CAP處理組的血滴表面變得干燥，可見細小的殼樣物與酒窩樣凹陷（圖2b）；當放電電壓和作用距離不變，作用時間延長至60 s時，CAP處理組的血滴表面干燥程度顯著增加，血滴表面凹陷數(shù)量明顯增多、凹陷面積明顯增大（圖2c）；當放電電壓和作用距離不變，作用時間增加至120 s時，可見CAP組血滴表面大部分區(qū)域變成殼樣物，凹陷數(shù)量進一步增多（圖2d）。上述結(jié)果提示，CAP具有明顯的促進血滴凝固作用，并且隨著CAP作用時間呈正相關(guān)。

圖2 CAP促進血滴凝固的時間效應Fig.2 Effects of treatment duration of CAP on blood coagulation

2.3 CAP促進血滴凝固的電壓效應

Control組血滴暴露于空氣中5 min后血滴形態(tài)幾乎沒有變化，中央?yún)^(qū)光滑透亮（圖3a）。與Control組相比，當CAP處理時間為120 s，作用距離為1 cm，放電電壓為3.33 kV時，CAP組血滴邊緣變得干燥且有凹陷形成，血滴中央依然光滑透亮（圖3b）；當CAP作用時間和作用距離不變，放電電壓增加為6.73 kV時，CAP組血滴大部分區(qū)域變得干燥形成殼樣物，血滴表面出現(xiàn)許較多細小凹陷，血滴中央仍可見小范圍光滑透亮區(qū)（圖3c）；當作用時間和作用距離保持不變，放電電壓增加為8.03 kV時，CAP組血滴表面殼樣物范圍增大，表面凹陷增多（圖3d）。上述結(jié)果提示，CAP可顯著促進血滴凝固，并且與CAP放電電壓呈正相關(guān)。

2.4 CAP對大鼠不同部位出血的凝血效果

與Control組相比，CAP組大鼠尾部、腳趾、股靜脈的出血時間和出血量均顯著降低（P＜0.05），見圖4。上述結(jié)果提示，CAP可以加速動物不同部位出血的凝血過程。

2.5 CAP對抗凝血滴的凝固作用

在觀察時間內(nèi)，Control組血滴形態(tài)幾乎沒有變化（圖5a）。與Control組相比，CAP組血滴表面變得干燥、血滴表面酒窩樣凹陷明顯增多（圖5b）。上述結(jié)果提示，CAP可以明顯促進枸櫞酸鈉抗凝血滴的凝固。

圖3 CAP促進血滴凝固的電壓效應Fig.3 Effect of discharge voltages of CAP on blood coagulation

圖4 CAP對大鼠不同部位出血的凝血效果Fig.4 Coagulation effect of CAP in rat models with different bleeding sites

圖5 CAP對抗凝血滴的凝固作用Fig.5 Effect of CAP on anticoagulant blood

3 討論

本論文研究所采用的CAP射流是外加電場電離稀有氣體后產(chǎn)生的含有大量帶電粒子、活性自由基、激發(fā)態(tài)中性粒子及光子等的第四類物質(zhì)狀態(tài)，其中的活性成分具有誘導惡性腫瘤細胞凋亡［11］、調(diào)節(jié)細胞聚集粘附與增殖［12］、加速化學反應［13］等功能。既往實驗室研究顯示，CAP可以促進血液樣本快速凝固，其機制可能與CAP中的氧自由基加速凝血化學反應有關(guān)［14］。另據(jù)報道，與傳統(tǒng)電凝止血相比，低溫等離子體對腺樣體肥大手術(shù)中的出血具有良好止血效果［6］。Fridman等[5]也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，即CAP可以顯著促進脾臟切口的血液凝固，且不產(chǎn)生明顯的組織損傷。

本研究為了篩選和探討常壓冷等離子體對血液凝固的影響并篩選其最佳參數(shù)，初步探討其作用機制，首先觀察了CAP對血滴凝固的影響。結(jié)果顯示，CAP可以明顯促進血滴凝固，主要表現(xiàn)為血滴表面殼樣物和酒窩樣凹陷形成以及干燥程度增加［15］。并且，CAP促凝血作用與CAP的處理時間、作用距離和放電電壓密切相關(guān)，該結(jié)果與Kuo等［15］的研究結(jié)果一致。進而，筆者采用血滴實驗篩選確定的CAP最佳凝血參數(shù)，觀察CAP對大鼠不同部位出血的促凝效果，發(fā)現(xiàn)與Control組相比CAP組大鼠尾部、腳趾和股靜脈的出血時間明顯縮短，出血量明顯降低，提示CAP對體外血滴具有明顯的促凝作用，對動物不同部位出血也具有明顯的凝血作用，該結(jié)果與Fridman［5］和 Kalghatgi［7］的研究結(jié)果一致。

隨后筆者利用CAP處理枸櫞酸鈉抗凝的血滴，結(jié)果顯示，CAP可以明顯促進抗凝血滴凝固。已有研究表明，枸櫞酸根離子可與血中的Ca2+相結(jié)合，形成不易離解的可溶性絡(luò)合物，通過降低血液中Ca2+濃度，抑制凝血。既往認為，等離子體可以通過氧化還原反應提高血液中Ca2+濃度，進而促進血液凝固［16］。然而，最新研究顯示，等離子體處理血液后，其pH值與Ca2+濃度均無顯著變化，提示CAP促進血液凝固，特別是枸櫞酸鈉抗凝血液凝固可能不是通過增加Ca2+濃度發(fā)揮作用［7］?？紤]到Ca2+參與凝血級聯(lián)反應的凝血酶原激活物形成和凝血酶形成過程，但不參與纖維蛋白形成，筆者認為，CAP可能主要是通過促進纖維蛋白原向纖維蛋白轉(zhuǎn)化而加速凝血過程。該推測與既往報道一致，即Kalghatgi等［7］利用等離子體處理人工合成的纖維蛋白原溶液后，溶液逐漸渾濁，提示等離子體可以啟動纖維蛋白原向纖維蛋白轉(zhuǎn)化。

綜上所述，我們認為CAP可以加速血液凝固并增強其凝血效果，該過程可能與CAP促進纖維蛋白原向為纖維蛋白轉(zhuǎn)化有關(guān)。