劉璐瑤 王 瑩 董小龍 林 麗 孫金嶠 王曉川

1 病例資料

1.1 病例報告

例1 男，13歲，因“PLT、Hb反復下降6年余”于2016年1月25日至復旦大學附屬兒科醫(yī)院(我院)就診。

患兒于2009年無明顯誘因出現(xiàn)皮膚淤青，就診于當?shù)蒯t(yī)院，發(fā)現(xiàn)PLT、Hb下降，考慮自身免疫性貧血、PLT減少性紫癜。曾給予激素、免疫球蛋白治療后PLT升至正常，溶血性貧血較前好轉(zhuǎn)，激素減量時病情易反復。2010年7月在上海市某兒童醫(yī)院行骨髓細胞學檢查：骨髓增生明顯活躍，粒紅比倒置，粒系增生相對減低，紅系增生明顯活躍，巨核系增生活躍。2013年就診于我院，考慮為自身免疫性溶血性貧血，免疫功能檢查示免疫球蛋白減低。2013至2016年接受激素治療，曾患真菌性肺炎。

患兒系G1P1，足月剖宮產(chǎn)。父母身體健康，否認近親結(jié)婚及家族相關遺傳性疾病史。既往有丙種球蛋白、紅細胞懸液、冷沉淀、白蛋白和纖維蛋白原輸注史。

體格檢查：神志清楚，反應良好，精神可，貧血貌。兩肺呼吸音粗，未及啰音。腹壁松弛，腹部皮紋明顯。肝肋下3 cm，劍突下3 cm，質(zhì)韌，有觸痛。脾肋下6 cm，質(zhì)韌，有觸痛。腹部叩診鼓音，腹壁靜脈顯露，移動性濁音陰性。因長期服用激素表現(xiàn)為庫欣貌，向心性肥胖，發(fā)育落后。

實驗室檢查：血常規(guī)WBC 7.3×109·L-1，L 1.8×109·L-1，N%為70.9%，CRP 16 mg·L-1；RBC 2.42×1012·L-1，Hb 55 g·L-1，網(wǎng)織紅細胞比例14.3%，抗C3陽性，抗IgG陽性，Coombs試驗血型單特異性抗體陽性，直接抗人球蛋白試驗陽性提示溶血性貧血。血生化ALT 206 IU·L-1，AST 255 IU·L-1；自身抗體陰性。外周血白細胞中EBV-DNA陽性(4.13×104拷貝數(shù)·mL-1)；真菌G試驗89.0 pg·mL-1；肺泡灌洗液宏基因檢測真菌弱陽性。

例2 男，3個月2 d，因“反復PLT減少3個月”于2018年8月7日至我院就診。

患兒出生后因“氣促，吐沫10 min”于外院就診。X線胸片提示新生兒肺炎，血常規(guī)PLT 19×109·L-1, CRP 9 mg·L-1, WBC 28.2×109·L-1，N% 85.4%，予抗感染，靜脈輸注丙種球蛋白2.5 g、PLT 60 mL，潑尼松1 mg·kg-1口服。黃疸明顯，診斷為新生兒高膽紅素血癥。病程中無明顯誘因出現(xiàn)發(fā)熱，伴外耳道癤腫破潰流膿，全身皮膚可見散在出血點。骨髓穿刺結(jié)果提示：骨髓增生活躍(粒系、紅系)，PLT較少見，可見巨核細胞，嗜酸性粒細胞比值偏高。生后有反復腹瀉，蛋花樣便，1月齡停母乳后好轉(zhuǎn)。

患兒系G2P1，41+1周產(chǎn)鉗助產(chǎn)出生，出生體重3 850 g，出生無窒息搶救史。母親第1胎于孕10周胎停。父母身體健康，否認近親結(jié)婚及家族相關遺傳性疾病史。

體格檢查：神志清楚，反應良好，精神可，發(fā)育正常；全身皮膚可見散在少許針尖大小出血點，全身淺表淋巴結(jié)未觸及腫大，腹軟，肝脾肋下未觸及；四肢肌力、肌張力可，中樞神經(jīng)系統(tǒng)檢查未見異常。

實驗室檢查：血常規(guī)WBC 9.6×109·L-1，L 6.1×109·L-1，N 1.02×109·L-1，嗜酸性粒細胞1 860個/μL，Hb 94 g·L-1，RBC 3.98×1012·L-1，PLT 10×109·L-1，網(wǎng)織紅細胞百分比 1.8%，CRP<8 mg·L-1。Coombs試驗陰性。尿有機酸質(zhì)譜結(jié)果顯示，3-羥基-苯乙酸-2、4-羥基-苯乳酸-2水平略高于正常。靜脈血EBV DNA陰性，CMV DNA陰性；外周血白細胞EBV DNA陰性。自身抗體陰性。

1.2 影像學檢查 例1 CT報告顯示兩肺廣泛多發(fā)斑片、結(jié)節(jié)影，縱隔多發(fā)腫大淋巴結(jié)影(圖1A)，考慮真菌感染的可能。B超報告膽囊內(nèi)密集占位，提示真菌感染(圖2A)；肝腫大，肝臟質(zhì)地欠佳，巨脾(圖2B)，脾靜脈增寬。例2 B超報告肝質(zhì)地欠佳(圖2C)；雙側(cè)頸部探及淋巴結(jié)，雙側(cè)腋下淋巴結(jié)腫大；雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)輕度腫大；脾臟未見明顯局灶性占位。腹部腸腔內(nèi)大量氣體。

圖1例1CT檢查結(jié)果

注 A：兩肺廣泛多發(fā)斑片、結(jié)節(jié)影，縱隔多發(fā)腫大淋巴結(jié)影。B：兩肺透亮度尚可，廣泛多發(fā)斑片、結(jié)節(jié)影較前有明顯好轉(zhuǎn)

圖22例患兒B超檢查結(jié)果

注 A：例1 膽囊內(nèi)密集占位；B：例1巨脾；C：例2肝質(zhì)地欠佳

1.3 免疫功能評價

1.3.1 常規(guī)免疫檢查 采用免疫比濁法檢測免疫球蛋白IgG、IgM和IgA的水平。使用熒光標記單克隆抗體分別標記外周血淋巴細胞亞群，其中抗CD19標記B細胞，抗CD3、抗CD8抗體標記CD8+T細胞，抗CD3、抗CD4抗體標記CD4+T細胞，抗CD16CD56抗體標記NK細胞，用流式細胞儀(BD Biosciences, San Jose, CA)分析結(jié)果。

1.3.2 淋巴細胞精細分型 取混勻的 50 μL肝素抗凝全血于流式管中，加入不同熒光素標記的小鼠抗人APC-CD19、BV421-CD27、BV510-IgD、PE-CD24和PERCP-CY5.5-CD38檢測B淋巴細胞不同分化發(fā)育亞群；使用小鼠抗人PE-TCRαβ、BV421-TCRγδ 、PERCP-CY5.5-CD3、FITC-CD4、BV510-CD8、APC-CD27和PE-CY7-CD45RA檢測T淋巴細胞不同分化發(fā)育亞群；混勻后室溫避光孵育；加入裂紅素裂解紅細胞。使用PBS緩沖液重懸后用BD Diva 軟件上機獲取數(shù)據(jù)并分析。

1.3.3 免疫功能評價 例1 IgG、IgA和IgM均下降，CD3+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞增多，CD4+T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞減少(表1)。例2 IgG升高，IgA和IgM在正常范圍，CD4+T淋巴細胞增多，CD8+T淋巴細胞減少，B淋巴細胞和NK細胞均在正常范圍(表1)。精細分型結(jié)果提示2例初始B細胞比例增高、記憶性B細胞降低(圖3、表1)；例1漿細胞(0.1%)、初始CD4+T細胞(1.6%)和CD8+T細胞(6.9%)比例下降，中央記憶性CD4+T細胞(81.5%)和CD8+T細胞(37.2%)比例增高(圖3、4)；例2 T淋巴細胞亞群精細分型大致正常(圖4)。

1.4 基因檢測 取得患兒父母知情同意后，抽取患兒及其父母外周靜脈血2 mL(EDTA 抗凝)，提取基因組 DNA(QIAGEN公司)，采用高通量測序法行全外顯子組測序。采用Sanger法和熒光定量PCR分別對點突變和缺失突變進行驗證。2例均為LRBA基因復合雜合突變(圖5A)。例1為c.1933C>T(p.R645X，母源)雜合突變和29號外顯子缺失雜合突變(父源)，c.1933C>T導致645位編碼精氨酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，導致蛋白翻譯提前終止，引起LRBA蛋白的異常截短，該突變位點在HGMD數(shù)據(jù)庫中尚未報道(圖5)。例2為c.3778G>C(p.A1260P, 母源)和c.1570G>A(p.G524S, 父源)復合雜合突變(外院檢測)。c.3778G>C(p.A1260P)在HGMD數(shù)據(jù)庫中尚未報道，經(jīng)mutation taster預測為致病突變；c.1570G>A(p.G524S)為HGMD數(shù)據(jù)庫中已報道的致病突變(CM1720278)。

表1 2例患兒免疫功能檢查

圖3 2例患兒B淋巴細胞亞群精細分型結(jié)果

圖4 2例患兒CD4+ T和CD8+ T淋巴細胞亞群精細分型結(jié)果

圖5基因檢測結(jié)果

注 A：LRBA蛋白結(jié)構(gòu)示意圖及2例患兒突變分布(例2：p.G524S和 p.A1260P)；B：例1及其母親均檢測到LRBA基因15號外顯子c.1933C>T(p.R645X)雜合突變；C：例1家系LRBA(exon 29)熒光定量檢測結(jié)果，例1及其父親均檢測到LRBA基因 29號外顯子雜合缺失

1.5 治療 例1入院后完善相關檢查，給予甲潑尼龍(80 mg q12 h)、免疫球蛋白(共40 g)抑制免疫反應、減少紅細胞破壞；輸注紅細胞；頭孢哌酮舒巴坦、伏立康唑抗感染，效果不佳，后加用卡泊芬凈抗真菌治療，肺部真菌感染癥狀好轉(zhuǎn)(圖1B)，Hb及PLT逐漸恢復正常，網(wǎng)織紅細胞逐漸下降，患兒病情好轉(zhuǎn)，定期輸注丙種球蛋白。因家庭原因未進行造血干細胞移植(HSCT)。

例2予靜脈輸注丙種球蛋白2.5 g及PLT，PLT較前無明顯上升。目前已行HSCT，臨床好轉(zhuǎn)中。

2 討論

LRBA (LPS-responsive beige-like anchor protein) 缺陷是LRBA基因發(fā)生雙等位基因功能缺失性突變所引起的一種原發(fā)性免疫缺陷病[1]。LRBA基因位于4q31.3，編碼LRBA蛋白，是BEACH-WD40蛋白家族成員之一，普遍存在于人體內(nèi)，在免疫細胞尤其是淋巴細胞中高度表達。目前LRBA缺陷具體的發(fā)病機制仍然不清楚，但是相關研究發(fā)現(xiàn)LRBA蛋白與蛋白激酶A結(jié)合，主要調(diào)節(jié)胞內(nèi)囊泡的轉(zhuǎn)運過程，有助于免疫效應分子如細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)的分泌和膜沉積過程[2]。CTLA-4在活化的T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)上表達，通過與共刺激分子CD28(CD80和CD86的配體)競爭或者直接通過跨細胞胞吞作用去除抗原遞呈細胞上的這類配體，從而發(fā)揮免疫抑制作用[3, 4]。 LRBA蛋白能夠穩(wěn)定CTLA-4胞漿內(nèi)尾端，防止其被溶酶體降解，LRBA缺陷導致活化的CD4+T細胞和Tregs上CTLA-4 的水平降低，從而出現(xiàn)一系列免疫失調(diào)的表現(xiàn)[2]。

LRBA缺陷在2012年[1]被提出后最先被歸為常見變異性免疫缺陷病(CVID)[1, 5]。目前多個研究發(fā)現(xiàn)部分LRBA缺陷的患者表現(xiàn)為自身免疫性疾病，如炎癥性腸病、類免疫失調(diào)-多發(fā)內(nèi)分泌病-腸病-X染色體連鎖(IPEX)綜合征和類自身免疫性淋巴增生綜合征(ALPS)等[6, 7]。LRBA缺陷主要表現(xiàn)為一種表型廣泛的免疫綜合征，在2017年免疫缺陷病分類中將其歸為免疫失調(diào)性疾病[8]。LRBA缺陷的臨床表現(xiàn)復雜多樣，主要包括低丙種球蛋白血癥、自身免疫性疾病、反復感染、免疫失調(diào)、肝脾腫大、肺部疾病以及易感EBV等，其中低丙種球蛋白血癥和慢性腹瀉最常見[9, 10]。LRBA缺陷患者免疫功能的異常主要包括IgG抗體產(chǎn)生減少，特異性抗體免疫應答缺陷，T淋巴細胞的增殖和活化功能缺陷，Treg細胞減少以及B淋巴細胞的自噬減少等。大多數(shù)LRBA缺陷的患者B淋巴細胞亞群的計數(shù)減少，尤其是類別轉(zhuǎn)換記憶性B細胞和漿細胞[1, 11]。

本文報告的2例LRBA缺陷患兒均有反復感染、血細胞減少和腹瀉等自身免疫性疾病的表現(xiàn)。淋巴細胞亞群精細分型結(jié)果提示，2例患兒初始B細胞比例明顯增高，記憶性B細胞比例降低。例1還表現(xiàn)為免疫球蛋白IgG、IgA、IgM水平下降，CD3+T和CD8+T淋巴細胞增多，CD4+T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞減少，漿細胞、初始CD4+T和CD8+T淋巴細胞比例下降，中央記憶性CD4+T和CD8+T淋巴細胞比例明顯增高等。例1的臨床表現(xiàn)以及免疫表型符合之前所報道的LRBA缺陷患兒的表現(xiàn)，但是例2與例1的表型不完全一致，這種現(xiàn)象說明LRBA缺陷復雜多樣的臨床表現(xiàn)可能受到發(fā)病的年齡、感染以及外界環(huán)境因素等的影響。兒童若出現(xiàn)早發(fā)型低丙種球蛋白血癥、嚴重的自身免疫性疾病、炎癥性腸病、淋巴組織增生和反復呼吸道感染等臨床表現(xiàn)，需考慮LRBA缺陷可能。

目前LRBA缺陷的治療手段主要包括阿巴西普靶向治療和HSCT。其中，HSCT也可以用于伴發(fā)嚴重疾病的患者[12]。阿巴西普是一種 CTLA-4免疫球蛋白融合藥物，通過與抗原提呈細胞上的 CD 80/86 結(jié)合抑制T 細胞激活，目前用于治療類風濕關節(jié)炎。之前有報道1 例CTLA-4 功能性突變的女孩在接受阿巴西普治療后，其自身免疫癥狀有所改善，F(xiàn)OXP3表達升高，Treg細胞功能恢復正常[13]。部分LRBA缺陷的患者接受阿巴西普治療后，間質(zhì)性肺病、自身免疫性疾病以及免疫表型都有了顯著的改善[14]。但是血細胞減少等臨床表現(xiàn)對阿巴西普治療的反應性比較差。

HSCT是根治LRBA缺陷的主要手段，相關臨床研究[12, 15-18]報道，已有12例LRBA缺陷患者接受了HSCT治療，總生存率為67% (8/12), 其中有6例臨床表現(xiàn)好轉(zhuǎn)[19]。本文例2行HSCT，目前正處于臨床好轉(zhuǎn)階段，例1因家庭原因目前還沒有接受HSCT治療。目前接受HSCT治療的LRBA缺陷的病例仍有限，效果尚待進一步研究。對于部分臨床表現(xiàn)復雜、相關并發(fā)癥嚴重的LRBA缺陷的患兒，若常規(guī)治療無效，可盡早行HSCT。