劉飛虎,吳強(qiáng)駒 ,崔小花 ,賀瑞峰, 張 曼, 師艷寧, 王國(guó)棟 ,賈 杰 ,劉 勇

1．西安市精神衛(wèi)生中心(西安 710100);2．西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部神經(jīng)生物學(xué)研究所(西安 710061)

精神分裂癥(Schizophrenia，SZ)是一種慢性的可致殘的精神疾病，其發(fā)病率約占世界總?cè)丝诘?%，無(wú)性別差異?；疾≌叱３霈F(xiàn)妄想、幻想、淡漠、缺乏動(dòng)力和精神緊張等現(xiàn)象[1]，受摧殘程度極大，80%～90%不能工作，死亡人數(shù)高達(dá)10%[2]。精神分裂癥的主要治療手段是服用抗抑郁藥物，然而，許多患者對(duì)這些藥物敏感性較低。因此，在精神分裂癥治療的過(guò)程中大量的輔助劑被使用。鋰(Lithium，Li)，雙相情感障礙(Bipolar disorder，BPD)的最完善的治療方法之一，可穩(wěn)定人的心情，因此是常用的抗精神病藥輔助劑。研究表明，鋰元素可以減輕躁狂癥和抑郁癥，增強(qiáng)許多抗抑郁藥和抗精神病藥物的功效[3-4]，同是也是評(píng)判卡馬西平[5]、丙戊酸鹽[6]和苯二氮卓類(lèi)藥物[7]作為精神分裂癥的唯一或輔助治療的方法，在精神分裂癥(如分裂樣精神病和分裂情感性精神病)的治療中扮演重要作用[8-9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，鋰幾乎可影響每一種神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，并且可改變離子運(yùn)輸，激素和晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)以及基因表達(dá)的機(jī)制[10-11]，所以推測(cè)其功效很可能不是由一種特殊的生化機(jī)制引起的。國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀表明，鋰在精神分裂癥發(fā)病和治療中扮演重要角色，但缺少臨床數(shù)據(jù)的支持。因此，本研究通過(guò)臨床調(diào)研，考察鋰元素與精神分裂癥關(guān)系，同時(shí)從基因?qū)用嫣骄窟@些精神分裂癥患者的發(fā)病機(jī)制，探索目的基因與鋰元素致精神分裂癥的內(nèi)在機(jī)制關(guān)系。

資料與方法

1 樣本收集 通過(guò)區(qū)域調(diào)研和臨床調(diào)研收集陜西省內(nèi)的精神分裂癥患者病例，采集樣本信息，評(píng)判精神分裂癥標(biāo)準(zhǔn)符合ICD-10關(guān)于精神分裂癥(偏執(zhí)型)診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡18～45歲,漢族；首次發(fā)病，病程不超過(guò)1年，未應(yīng)用抗精神病藥物; PNASS評(píng)分≥60分。所有患者均同意簽訂知情同意書(shū)，經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。采集不同區(qū)域的日常飲用水(西安碑林、蓮湖、雁塔、新城、未央為日常城市用水，銅川市、禮泉縣、眉縣、安康市、耀州區(qū)、城固縣采集點(diǎn)的飲用水為井水，其中銅川采集點(diǎn)位于煤礦地區(qū))，收集正常人和患病者血液(靜脈血5 ml，3000 r/分離心5 min后-80℃冰箱凍存)和頭發(fā)。

2 ELISA檢測(cè)血清內(nèi)相關(guān)因子 ELISA 檢測(cè)血清內(nèi)相關(guān)基因Bcl-2(B淋巴細(xì)胞瘤-2)、GSK3-3β(糖原合成酶激酶-3β)、CSF2RA(粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體α)、NRG1(神經(jīng)調(diào)節(jié)素1蛋白)、ErbB4(受體酪氨酸激酶4)的蛋白表達(dá)水平，所有ELISA 試劑盒均來(lái)自Invitrogen公司。

3 熒光定量PCR檢測(cè)血清內(nèi)相關(guān)基因mRNA TRI Reagent(sigma，T3809)提取血清總RNA，DNaseI recombinant(sigma，4716728001，RNase-free)去除DNA干擾，最終測(cè)RNA的OD260/OD280值均在1.8～2.0之間，表明RNA質(zhì)量合格。使用cDNA Synthesis Kit(sigma, 11117831001)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SYBR Green PCR Master Mix kit(sigma, 4673484001)進(jìn)行Real-time PCR 分析，體系為20 μl(95 ℃，2 min，40cycle(94 ℃，35 s、55～61 ℃，45 s和72 ℃，35 s)，72 ℃，5 min)。溶解曲線為單一峰值表示反應(yīng)均為特異性反應(yīng)。引物序列如表1。

表1 引物序列

結(jié)果

1 頭發(fā)內(nèi)鋰的含量 不同地區(qū)正常人和精神分裂癥患者頭發(fā)中鋰的含量結(jié)果顯示，與正常人相比，精神分裂癥患者頭發(fā)中鋰的含量顯著降低(P<0.05)。雖然銅川縣正常人和精神分裂分裂癥患者頭發(fā)內(nèi)鋰的含量并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但精神分裂癥患者頭發(fā)低的含量較正常人呈下降趨勢(shì)(見(jiàn)表2)。

2 不同區(qū)域水質(zhì)內(nèi)鋰的含量 與農(nóng)村地區(qū)(禮泉，眉縣，華陰，銅川，耀州區(qū)，延安，榆林，安康，城固，商洛)相比，城市地區(qū)(西安碑林、蓮湖、雁塔、新城、未央)飲用水中鋰元素的含量較低(見(jiàn)圖1)。

3 血清內(nèi)相關(guān)因子ELISA ELISA結(jié)果顯示：與正常組相比，B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)和水平糖原合成酶激酶3β的磷酸化水平(GSK3β)(Ser9)在精神分裂癥患者血清內(nèi)的蛋白表達(dá)量顯著下降，神經(jīng)調(diào)節(jié)素1蛋白(NRG1)及其受體酪氨酸激酶4(ErbB4)和粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體α(CSF2RA)的蛋白表達(dá)水平顯著上升(P<0.05，n=30，圖2)。

4 熒光定量PCR檢測(cè)血清內(nèi)相關(guān)基因mRNA Real-time PCR結(jié)果顯示：與正常組相比，精神分裂癥患者血清內(nèi)Bcl-2和GSK3-3β的mRNA表達(dá)水平顯著下降，NRG1、ErbB4和CSF2RA的mRNA表達(dá)水平顯著上升(P<0.05，n=30，圖3)。

圖1 不同區(qū)域水質(zhì)內(nèi)鋰的含量

不同區(qū)域 正常人頭發(fā)Li患病者頭發(fā)Li安 康 0.5844±0.00960.3861±0.0054?城 固 0.3536±0.00420.1770±0.0048?商 洛 0.1814±0.00130.0808±0.0010?西 安雁 塔 區(qū)0.1681±0.00330.1151±0.0060? 碑 林 區(qū)0.4993±0.01910.2025±0.0052? 新 城 區(qū)0.6652±0.00250.1620±0.0021? 蓮 湖 區(qū)0.4139±0.00910.1256±0.0324? 未 央 區(qū)0.1770±0.00420.0908±0.0041?禮 泉 0.3627±0.00320.1801±0.0046?眉 縣 0.6330±0.01000.2112±0.0083?華 陰 0.1622±0.00670.1107±0.0012?銅 川 0.1535±0.00120.1399±0.0089耀 州 區(qū) 0.1032±0.00090.0458±0.0002?延 安 0.2374±0.00320.0893±0.0007?榆 林 0.6732±0.00840.1959±0.0091?

注：與正常人比較，*P<0.05

圖2 血清內(nèi)GSK-3β、NRG1、ErbB4、Bcl-2和CSF2RA的蛋白表達(dá)情況

圖3 血清內(nèi)GSK-3β、NRG1、ErbB4、Bcl-2和CSF2RA的mRNA表達(dá)情況

大量的腦部圖像和尸檢研究表明，有害的可塑性變化如腦萎縮和神經(jīng)元丟失與精神分裂癥和雙相情感障礙的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。鋰，一種原型情緒穩(wěn)定劑，具有強(qiáng)大的可塑性作用，如保護(hù)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞免受各種神經(jīng)毒性干擾，提高神經(jīng)元的生存率，提高成年人的記憶力和促進(jìn)突觸的可塑性[9]。有研究表明，在精神分裂癥的治療方面，就指標(biāo)參數(shù)而言，鋰和安慰劑無(wú)顯著差異。本研究通過(guò)臨床調(diào)研，考察鋰元素與精神分裂癥關(guān)系，同時(shí)從基因?qū)用嫣骄夸囋刂戮穹至寻Y的內(nèi)在機(jī)制關(guān)系。

神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(NRG1))屬于精神營(yíng)養(yǎng)因子，與精神分裂癥密切相關(guān)，ErbB4，作為神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(NRG1)受體蛋白，是一個(gè)潛在的精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)基因。NRG1-ErbB4信號(hào)與GABAergic谷氨酸和參與精神分裂癥病理生理的多巴胺神經(jīng)傳遞系統(tǒng)密切相關(guān)，可調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)信號(hào)傳遞，在精神分裂癥的病理生理學(xué)過(guò)程中扮演重要角色。本課題的研究結(jié)果顯示，精神分裂癥患者血清內(nèi)NRG1和ErbB4 mRNA和蛋白的水平顯著升高。此外，炎癥細(xì)胞因子粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體α(CSF2RA)的表達(dá)也顯著升高，這與先前的研究在精神分裂癥患者血清和腦脊液內(nèi)的炎性細(xì)胞因子及其受體的水平升高結(jié)果一致。鋰可通過(guò)直接調(diào)節(jié)肌醇單磷酸酶活性和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)發(fā)揮治療作用。本研究顯示，與正常人相比，精神分裂癥患者血清內(nèi)GSK-3β和Bcl-2的mRNA和蛋白水平顯著下降，這與前人關(guān)于碳酸鋰可恢復(fù) Ouabain(哇巴因)降低糖原合成酶激酶3β的磷酸化水平(GSK3β)(Ser9)和Bcl-2/Bax的比值以及精神分裂癥患者死后的大腦中GSK-3β的mRNA和蛋白水平降低的研究一致。

通過(guò)本課題的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)飲水中鋰元素偏低的地區(qū)，其精神分裂癥患者比例顯著升高，且頭發(fā)內(nèi)鋰元素含量也顯著低于正常人。同時(shí)，血清的檢測(cè)結(jié)果表明，精神分裂癥患者血清內(nèi)精神營(yíng)養(yǎng)因子NRG1及其受體ErbB4，以及炎癥細(xì)胞因子CSF2RA的蛋白和mRNA水平顯著高于正常人，而鋰的作用靶點(diǎn)GSK3β以及神經(jīng)保護(hù)因子B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤2(Bcl-2)的表達(dá)顯著下降。這表明，精神分裂癥的發(fā)生可能與不同地域中水質(zhì)內(nèi)鋰的含量的高低有關(guān)。所以本課題組下一步將結(jié)合抗精神病藥治療前后的蛋白質(zhì)的變化，探討鋰與精神分裂癥發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，期望可以降低精神疾病總負(fù)擔(dān)。