何 遠(yuǎn)，石建麗，嚴(yán)榴芽

(余姚市人民醫(yī)院藥劑科，浙江 余姚，315400)

近幾年來(lái)，臨床上應(yīng)用中藥注射液造成的不良事件時(shí)有發(fā)生，因此，中藥注射液的成品輸液穩(wěn)定性已經(jīng)逐漸成為研究的熱點(diǎn)[1]。為了探討中藥注射液從配制到輸液過(guò)程中質(zhì)量的變化，以及室內(nèi)光照對(duì)中藥注射液成品輸液穩(wěn)定性的影響，本研究考察了苦黃注射液的質(zhì)量及成品輸液的穩(wěn)定性，以期為臨床安全用藥提供參考，減少不良事件的發(fā)生?？帱S注射液是由苦參、大黃、茵陳蒿、柴胡和大青葉經(jīng)過(guò)加工制成的純中藥復(fù)方靜脈注射液，臨床上具有清熱利濕、疏肝退黃的效果[2-3]，主要用于因濕熱內(nèi)蘊(yùn)引起的黃疸型病毒性肝炎的治療。本研究采用UPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)苦黃注射液的有效成分進(jìn)行質(zhì)量控制，并模擬臨床用藥對(duì)其成品輸液進(jìn)行穩(wěn)定性考察。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

UPLC色譜儀(配有30型二元高壓梯度泵、1100型柱溫箱、1100型自動(dòng)進(jìn)樣器，日本島津)，STQ5500型串聯(lián)四級(jí)桿線性離子肼質(zhì)譜儀(電噴霧離子化源和三重四級(jí)桿線性離子肼串聯(lián)質(zhì)量分析器，美國(guó)AB公司)，電子分析天平(精密度0.000 1 g，美國(guó)梅特勒公司)，KQ2700型120 W超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

苦參堿(批號(hào)：20161214)、槐國(guó)堿(批號(hào)：20170223)、大黃素(批號(hào)：20170412)、大黃酸(批號(hào)：20161223)、蘆薈大黃素(批號(hào)：20170212)、柴胡皂苷a(批號(hào)：20170126)均購(gòu)自國(guó)家食品藥品檢定研究院?？帱S注射液(批號(hào)：1610231、1702281、1706141，常熟雷允上制藥有限公司)，甲醇、甲酸為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1液相色譜條件

色譜柱為Diamonsil-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)，柱溫為26 ℃，流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1%甲酸緩沖溶液(B)，梯度洗脫(0～3.5 min，22%～51%A；3.5～5.0 min，51%～74%A；5.0～8.0 min，74%～94%A；8.0～11.0 min，94%～94%A)，流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為10 μl。

1.2.2質(zhì)譜條件

ESI源，源噴射電壓為4 500～5 500 V；離子源溫度為600 ℃，霧化氣壓力為4.15×105Pa，加熱氣壓力為4.50×105Pa，工作模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。正負(fù)離子同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)監(jiān)測(cè)?？鄥A、槐國(guó)堿、蘆薈大黃素采用ESI+監(jiān)測(cè)，大黃酸、大黃素、柴胡皂苷a采用ESI-監(jiān)測(cè)。

1.2.3混合對(duì)照品溶液的配制[4]

分別精密稱取苦參堿、槐國(guó)堿、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、柴胡皂苷a對(duì)照品適量，分別置于5 ml容量瓶中，甲醇溶液溶解，定容至刻度，搖勻，即得各組分單一對(duì)照品溶液。精密量取上述單一對(duì)照品溶液各適量，置于同一5 ml容量瓶中，甲醇溶液稀釋，定容至刻度，搖勻，即可得到苦參堿80 ng/ml、槐國(guó)堿70 ng/ml、大黃素10 ng/ml、大黃酸168 ng/ml、蘆薈大黃素391 ng/ml、柴胡皂苷a 95 ng/ml的混合對(duì)照品溶液，采用流動(dòng)相逐級(jí)進(jìn)行稀釋為不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，置于冰箱中(2～8℃)儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4供試品溶液的配制[5]

分別精密量取不同批號(hào)的苦黃注射液1 ml置于10 ml容量瓶中，加入甲醇-水(1∶1，V/V)溶液稀釋定容，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即可得到稀釋10倍的苦黃注射液，用于蘆薈大黃素和柴胡皂苷a的測(cè)定。將前述稀釋10倍的苦黃注射液繼續(xù)用甲醇-水(1∶1，V/V)溶液稀釋，得到稀釋4 000倍的苦黃注射液供試品，用于苦參堿、槐國(guó)堿、大黃素和大黃酸的測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1線性關(guān)系考察

將“1.2.3”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液按照“1.2”項(xiàng)下的UPLC-MS/MS條件進(jìn)樣分析，以對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：

苦參堿：Y=3.75×105X+6.94×104，

r=0.999 7；

槐國(guó)堿：Y=2.14×105X+1.85×104，

r=0.999 4；

大黃素：Y=1.09×106X+4.32×104，

r=0.999 6；

大黃酸：Y=4.39×104X+2.24×105，

r=0.999 1；

蘆薈大黃素：Y=1.87×104X+2.61×104，

r=0.999 4；

柴胡皂苷a:Y=4.37×105X+1.14×104，

r=0.999 4。

結(jié)果表明，苦參堿、槐國(guó)堿、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、柴胡皂苷a分別在1.25～80.21、1.12～71.23、0.15～10.45、2.54～168.74、6.12～392.56、1.49～95.02 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2精密度試驗(yàn)

取同一批次苦黃注射液按照“1.2.4”項(xiàng)下制備得到稀釋10倍的供試品溶液和稀釋4 000倍的供試品溶液各6份，按照“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄6種成分的色譜峰面積，計(jì)算RSD值，分別為1.02%、0.98%、1.01%、1.10%、0.99%、1.08%，表明儀器的精密度較好。

2.1.3重復(fù)性試驗(yàn)

取同批次苦黃注射液，按照“1.2.4”項(xiàng)下的制備方法配制稀釋10倍和稀釋4 000倍的供試品溶液各6份，分別按照“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄6種成分的色譜峰面積，計(jì)算含量?？鄥A、槐國(guó)堿、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、柴胡皂苷a的平均含量分別為198.74、114.12、2.44、100.37、2.21、0.021 μg/ml，RSD分別為2.14%、1.98%、2.02%、2.14%、2.17%、1.99%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4加樣回收率試驗(yàn)

取同一批次的苦黃注射液，分別加入6種有效成分的2種不同濃度，按照“1.2.4”項(xiàng)下的供試品溶液制備稀釋10倍的溶液后，按照“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算平均加樣回收率，結(jié)果如表1所示。

表1 苦黃注射液加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=4)

2.1.5樣品含量測(cè)定

取批號(hào)161023、170228、170614的3批次苦黃注射液，按照“1.2.4”供試品制備的步驟進(jìn)行稀釋配制后，按照“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

表2 樣品有效成分含量測(cè)定結(jié)果(ρB/μg·ml-1，n=3)

2.2 苦黃注射液成品輸液穩(wěn)定性考察

模擬臨床用藥的濃度以及輸液條件，于靜脈用藥配制中心由專業(yè)的藥學(xué)人員在水平層流型潔凈工作臺(tái)上取苦黃注射液3支(每支10 ml)，分別加入5%葡萄糖注射液250 ml、10%葡萄糖注射液250 ml，果糖注射液250 ml中，即可得到高濃度苦黃注射液成品輸液；再取苦黃注射液3支(每支5 ml)，分別加入5%葡萄糖注射液250 ml、10%葡萄糖注射液250 ml、果糖注射液250 ml即可得到低濃度苦黃注射液成品輸液。對(duì)于最大劑量、最小劑量的苦黃成品輸液按照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》中的規(guī)定和相關(guān)檢測(cè)方法[4]，分別在室內(nèi)光照(照度4 500 lx)下、遮光條件下室溫放置36 h，并在0、1、2、3、4、6、8、10、12、14、20、24、30、36 h對(duì)其進(jìn)行外觀、可見(jiàn)異物、含量、pH值以及不溶性微粒的檢測(cè)。結(jié)果：①各個(gè)成品輸液在36 h均澄清，無(wú)明顯的混濁和沉淀產(chǎn)生，顏色無(wú)明顯的變化，為深黃色的澄清溶液。②低濃度室內(nèi)光照的10%葡萄糖注射液的成品輸液pH在6 h后顯著升高；高濃度組5%葡萄糖注射液與10%葡萄糖注射液的成品輸液pH值呈下降的趨勢(shì)，低濃度組5%葡萄糖注射液的pH值則略微升高，遮光條件下保存的成品溶液穩(wěn)定性比光照條件下的好；果糖注射液的成品輸液呈中性。③除高濃度時(shí)，果糖注射液的成品輸液24 h后的微粒值不符合規(guī)定，其余各個(gè)濃度組的微粒值在36 h內(nèi)均符合規(guī)定，結(jié)果如表3所示。

3 討論

3.1 樣品的處理方式以及離子化模式的確定

在對(duì)苦黃注射液多組分成分進(jìn)行測(cè)定時(shí)，其中的苦參堿、槐國(guó)堿、蘆薈大黃素在正離子模式下的響應(yīng)值較好，大黃酸、大黃素、柴胡皂苷a在負(fù)離子模式下的響應(yīng)值最好[5-7]。在離子掃描結(jié)果中，苦參堿、槐國(guó)堿為苦參型生物堿逐步開(kāi)環(huán)裂解，分別產(chǎn)生子離子。

表3 3種苦黃成品輸液的穩(wěn)定性

因此，采用正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測(cè)的模式，可以在同一分析周期內(nèi)對(duì)苦黃注射液中的6種有效成分進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)，為中藥苦黃注射液的質(zhì)量控制提供有效的實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)[8-9]，大大縮短了分析的時(shí)間，提高了分析檢測(cè)的效率。

3.2 成品輸液中溶媒的確定以及穩(wěn)定性

中藥注射劑在給患者輸液過(guò)程中常常會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)事件[10]，臨床一般按照說(shuō)明書(shū)選擇5%葡萄糖注射液或者10%葡萄糖注射液作為苦黃注射液的溶媒，但不宜使用0.9%氯化鈉注射液作為溶媒，主要原因是苦黃注射液一旦加入電解質(zhì)會(huì)發(fā)生鹽析作用，產(chǎn)生微?；虺恋?，因此，本研究不選擇0.9%氯化鈉注射液，而選擇5%葡萄糖注射液和10%葡萄糖注射液[11-12]，并對(duì)兩者進(jìn)行外觀、可見(jiàn)異物、含量、pH值以及不溶性微粒的檢測(cè)，結(jié)果表明，除光照條件下pH值有不同程度的增加之外，其余質(zhì)量指標(biāo)均符合合格標(biāo)準(zhǔn)。

本研究還選擇了果糖注射液為溶媒進(jìn)行配伍穩(wěn)定性研究，考察糖尿病患者是否可以用果糖注射液代替葡萄糖注射液作為溶媒，以便為糖尿病患者的合理用藥提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)支持[13-15]?？帱S注射液及其成品輸液在儲(chǔ)存過(guò)程中對(duì)光照穩(wěn)定性差，并且在最大劑量組中果糖注射液的成品輸液24 h后微粒值不符合規(guī)定，在臨床使用時(shí)，應(yīng)注意上述引起質(zhì)量變化的不穩(wěn)定因素，以達(dá)到最大程度的安全治療。