徐曉麗，尤宏?duì)?，姚學(xué)良，李 灝，李 軍，包海巖

( 天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，天津 300221 )

目前關(guān)于豹紋鰓棘鱸相關(guān)報(bào)道較少，主要集中在人工育苗技術(shù)，池塘及工廠化養(yǎng)殖模式，溫度、鹽度、飼料、光照等對(duì)其生理指標(biāo)、生長(zhǎng)、行為的影響等方面[1-3]，病害相關(guān)的研究較少，僅見(jiàn)豹紋鰓棘鱸感染寄生蟲(chóng)病、弧菌病的報(bào)道[4-6]。本試驗(yàn)針對(duì)天津地區(qū)工廠化車(chē)間內(nèi)養(yǎng)殖的患類(lèi)結(jié)節(jié)癥的豹紋鰓棘鱸開(kāi)展病原分離、鑒定及病原耐藥性分析等研究，為養(yǎng)殖生產(chǎn)中該病的有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

患病豹紋鰓棘鱸取自天津?yàn)I海新區(qū)某工廠化養(yǎng)殖車(chē)間，病魚(yú)全長(zhǎng)約15 cm，車(chē)間內(nèi)養(yǎng)殖水溫23 ℃。試驗(yàn)用健康豹紋鰓棘鱸取自萊州明波水產(chǎn)有限公司，全長(zhǎng)(13±3) cm，暫養(yǎng)于60 L水族箱，7 d后分組開(kāi)始進(jìn)行感染試驗(yàn)。豹紋鰓棘鱸生性?xún)疵?，耗氧量較大，暫養(yǎng)期間為保持氧氣充足，增加循環(huán)水過(guò)濾裝置，投餌2次/d，暫養(yǎng)水溫24 ℃，鹽度20。

1.2 病原分離

取瀕死豹紋鰓棘鱸，觀察體表，取體表黏液、鰓等制作水浸片，顯微鏡下排查寄生蟲(chóng)和真菌感染，解剖，檢視內(nèi)部臟器病變，確定疾病典型癥狀。細(xì)菌分離采用接種針刺法進(jìn)行，分別從病魚(yú)的肝臟、脾、腎刺入，在腦心浸液平板培養(yǎng)基(購(gòu)自BD biosciences)上劃線，過(guò)夜培養(yǎng)(28 ℃)，第2 d挑取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化，直至獲得純培養(yǎng)菌株061101，將菌株061101轉(zhuǎn)接到腦心浸液液體培養(yǎng)基(購(gòu)自BD biosciences)中培養(yǎng)，并于-80 ℃冰箱中凍存。

1.3 人工感染試驗(yàn)

將菌株061101接種于添加了10%新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的腦心浸液液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，用0.01 mol/L的滅菌磷酸鹽緩沖液調(diào)整菌懸液密度為3×108cfu/mL，之后10倍比稀釋至3×104cfu/mL，作為感染試驗(yàn)用菌液。

感染試驗(yàn)分為6組，每組10尾健康的豹紋鰓棘鱸，其中5組為試驗(yàn)組，1組為對(duì)照組，試驗(yàn)組分別進(jìn)行腹腔注射不同倍比稀釋密度的菌懸液，對(duì)照組注射無(wú)菌磷酸鹽緩沖液，劑量均為100 μL/尾。

注射后每日觀察并記錄被感染魚(yú)發(fā)病癥狀和死亡數(shù)，飼養(yǎng)方法同暫養(yǎng)期間，試驗(yàn)持續(xù)14 d，參照改良的寇氏法計(jì)算半數(shù)致死密度[7]，另取感染癥狀典型的瀕死魚(yú)再次進(jìn)行病原分離。

1.4 細(xì)菌鑒定

細(xì)菌鑒定采用傳統(tǒng)的形態(tài)、生化特性鑒定方法結(jié)合16S rRNA基因序列分析進(jìn)行。

1.4.1 形態(tài)及生化指標(biāo)

取純化培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)菌株061101接種于腦心浸液平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察菌株061101的菌落特征，制備菌株061101的菌懸液滴片，革蘭氏染色。菌株生化特性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[8-9]方法進(jìn)行，生化鑒定管購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.4.2 菌株061101的16S rRNA 基因序列分析

以菌株061101菌懸液為模板擴(kuò)增16S rRNA基因序列[10]，PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(北京)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，BLAST分析后選取同源性較高的基因序列進(jìn)行多序列匹配排列，之后以16S rRNA基因?yàn)檫z傳標(biāo)記，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，所用軟件為Mega 5.1，自檢次數(shù)1000次。

1.5 敏感藥物篩選

篩選敏感藥物采用藥敏紙片法[10]，藥敏紙片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司，試驗(yàn)結(jié)果判斷按照藥敏紙片抑菌解釋標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 典型癥狀

患病豹紋鰓棘鱸游泳異常，不攝食；眼球充血，眼泡腫脹，眼瞼內(nèi)充滿(mǎn)透明液體鼓出或下垂；蛀鰭；解剖可見(jiàn)肝臟充血發(fā)紅至黑，肝臟、脾臟、腸系膜上遍布大小不一的白色結(jié)節(jié)，形狀不規(guī)則，腎臟壞死，呈黑色米粒狀(圖1)。顯微鏡下未發(fā)現(xiàn)真菌及寄生蟲(chóng)感染。

圖1 病魚(yú)典型癥狀

2.2 病原分離

自患病魚(yú)內(nèi)臟分離到優(yōu)勢(shì)菌061101，腹腔注射感染證實(shí)，菌株061101確能導(dǎo)致健康魚(yú)內(nèi)臟出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)并死亡，結(jié)節(jié)大小約0.1 mm，為引起本次類(lèi)結(jié)節(jié)癥的病原菌。該菌在腦心浸液平板培養(yǎng)基上呈圓形、邊緣光滑整齊且濕潤(rùn)的無(wú)色半透明菌落，菌落黏稠；染色結(jié)果顯示，菌體為革蘭氏陰性短桿狀，長(zhǎng)約0.8～2.6 μm，有莢膜，無(wú)芽孢，在血平板上呈現(xiàn)明顯的β溶血(圖2)。

圖2 菌株061101菌體形態(tài)

2.3 感染試驗(yàn)

以純培養(yǎng)的菌株061101感染健康豹紋鰓棘鱸，12 d后高密度菌懸液組試驗(yàn)魚(yú)全部死亡，累積死亡曲線見(jiàn)圖3。解剖發(fā)現(xiàn)，魚(yú)體內(nèi)臟腸系膜處出現(xiàn)多處白點(diǎn)，肝臟發(fā)紅，腎臟壞死發(fā)黑，而對(duì)照組未表現(xiàn)出任何癥狀，無(wú)一死亡。取感染試驗(yàn)的瀕死魚(yú)，分離細(xì)菌，得到大量菌落形態(tài)高度一致的細(xì)菌，經(jīng)鑒定所分離菌株的形態(tài)與菌株061101相同，16S rRNA基因序列100%一致，表明菌株061101感染成功，對(duì)豹紋鰓棘鱸具有致病性。按改良的寇氏法計(jì)算半數(shù)致死密度[7]，菌株061101對(duì)體質(zhì)量為33 g豹紋鰓棘鱸的半數(shù)致死密度為9.49×104cfu/mL(表1)，屬?gòu)?qiáng)毒力菌株[11]。

圖3 感染試驗(yàn)累積死亡率曲線

組別菌液密度cfu/mL注射劑量mL試驗(yàn)魚(yú)數(shù)尾日死亡數(shù)/尾1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d8 d9 d10 d11 d12 d13 d14 d累積死亡率%半致死密度cfu/mL試驗(yàn)組13×108試驗(yàn)組23×107試驗(yàn)組33×106試驗(yàn)組43×105試驗(yàn)組53×104對(duì)照組磷酸鹽緩沖液0.10.110001213001200001001000101210211100100100000011022110080100000000112021070100000000021010150100000000000000009.49×104

2.4 生化特性

生化鑒定結(jié)果顯示，菌株061101氧化酶、接觸酶均為陽(yáng)性，典型β溶血，不具運(yùn)動(dòng)性，無(wú)法水解七葉苷，不能產(chǎn)生淀粉酶；發(fā)酵型代謝，甲基紅、尿酶陽(yáng)性，可還原硝酸鹽，無(wú)法利用檸檬酸鹽、丙二酸鹽，V-P 試驗(yàn)陰性，不能產(chǎn)生賴(lài)氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、β-半乳糖苷酶及吲哚，精氨酸雙水解酶陽(yáng)性，硫化氫試驗(yàn)陰性，糖利用方面僅能利用葡萄糖，不能利用蔗糖、木糖、肌醇、鼠李糖、阿拉伯糖、苦杏仁苷等(表2)。根據(jù)生化特性，將菌株061101判定為美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種(Photobacteriumdamselassp.piscicida)。

表2 菌株061101和美人魚(yú)發(fā)光桿菌的生化特性比較

注：“+”，陽(yáng)性反應(yīng)；“-”，陰性反應(yīng)；“d”，11%～89%菌株為陽(yáng)性.

2.5 16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用通用引物27F和1492R擴(kuò)增菌株061101的16S rRNA基因，得到長(zhǎng)度約1500 bp的基因片段。序列比對(duì)結(jié)果表明，菌株061101與美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種的16S rRNA基因序列高度一致，基于鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，菌株061101與美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種(X78105.1)聚為一支，置信度達(dá)100%(圖4)。結(jié)合菌株061101的形態(tài)及生化特性，鑒定該病原菌株為美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種。

2.6 藥物敏感性

藥敏紙片法試驗(yàn)結(jié)果顯示，美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種061101僅對(duì)高含量的鏈霉素(300 μg/片)和慶大霉素(120 μg/片)敏感，對(duì)水產(chǎn)常規(guī)抗生素類(lèi)藥物恩諾沙星、氟苯尼考均耐藥，對(duì)多黏菌素B、環(huán)丙沙星、阿洛西林等中度敏感(表3)。

圖4 以16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

抗生素藥物含量μg/片敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)/mmRIS抑菌圈直徑mm敏感性呋喃唑酮300≤1415～16≥177.4R氟苯尼考75≤1213～17≥188.0R恩諾沙星5≤1213～16≥178.7R鏈霉素300≤67～9≥1014.5S鏈霉素10≤1112～14≥156.5R紅霉素15≤1314～22≥236.5R利福平5≤1617～19≥209.3R多黏菌素B300≤89～11≥1210.3I強(qiáng)力霉素30≤1213～15≥168.9R阿洛西林75≤1718～20≥2118.2I左氟沙星5≤1314～16≥178.1R復(fù)方新諾明75≤1011～15≥166.1R環(huán)丙沙星15≤1516～20≥2117.4IO/129敏感性150--≥76.2R慶大霉素120≤67～9≥1011.2S克拉霉素15≤1314～17≥189.5R甲氧芐啶5≤1011～15≥167.7R丁胺卡那霉素30≤1415～16≥1715.8I

注：R，耐藥；S，敏感；I，中度敏感.

3 討 論

3.1 美人魚(yú)發(fā)光桿菌的致病性

美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種是魚(yú)類(lèi)類(lèi)結(jié)節(jié)癥亦稱(chēng)巴斯德氏菌病的病原，又名殺魚(yú)巴斯德氏菌(Pasteurellapiscicida)。類(lèi)結(jié)節(jié)癥于1969年首次在日本發(fā)現(xiàn)，主要危害日本魚(yú)(Seriola)養(yǎng)殖業(yè)，后來(lái)發(fā)現(xiàn)該菌廣泛分布于海洋環(huán)境中，宿主多樣，致病性強(qiáng)，現(xiàn)已陸續(xù)在養(yǎng)殖的大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocea)、龍膽石斑魚(yú)(Epinepheluslanceolatus)、金頭鯛(Sparusaurata)、鲆鰈類(lèi)、鯔魚(yú)(Mugilcephalus)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)、卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)、魚(yú)(Miichthysmiiuy)、鱸魚(yú)等魚(yú)類(lèi)中發(fā)現(xiàn)美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種感染，影響范圍廣泛[12-19]。自患病豹紋鰓棘鱸內(nèi)臟中分離到該菌，感染試驗(yàn)也證明其致病性，這在國(guó)內(nèi)外均屬首次。美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種感染不同魚(yú)類(lèi)表現(xiàn)出的癥狀有較大差異，但肝臟充血、內(nèi)臟出現(xiàn)大量大小不等、形狀不規(guī)則的白色結(jié)節(jié)為其共有癥狀。該研究中，患病豹紋鰓棘鱸內(nèi)臟感染嚴(yán)重，白色結(jié)節(jié)數(shù)量很多，腎臟已壞死呈黑色米粒狀，自肝臟、腎臟中分離得到大量菌落形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌，證實(shí)了病原菌具有較強(qiáng)致病作用，菌株061101在血平板上呈典型的β溶血，說(shuō)明該菌胞外產(chǎn)物中含溶血因子，能夠使宿主血細(xì)胞溶解，這也是宿主造血器官受損失最嚴(yán)重的原因之一。本研究豐富了美人魚(yú)發(fā)光桿菌及豹紋鰓棘鱸疾病的研究資料，也為養(yǎng)殖中疾病防治提供了參考。

3.2 細(xì)菌鑒定結(jié)果分析

本研究對(duì)菌株061101的菌種判定，是通過(guò)形態(tài)、生化特性等傳統(tǒng)分類(lèi)指標(biāo)、結(jié)合16S rRNA 基因序列分析進(jìn)行的。菌株061101在系統(tǒng)發(fā)育分析中與美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種聚為一類(lèi)，但個(gè)別生化指標(biāo)與分類(lèi)手冊(cè)上記載的存在一些差異，與不同宿主源分離的美人魚(yú)發(fā)光桿菌也有差異，可能區(qū)域性的地方分離菌株間會(huì)存在個(gè)別生化指標(biāo)差異，在對(duì)細(xì)菌鑒定時(shí)不能僅僅依賴(lài)于生化指標(biāo)的完全一致性[16]。

3.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析

生產(chǎn)上對(duì)于魚(yú)類(lèi)細(xì)菌病的治療主要依靠抗生素。但本試驗(yàn)所分離的美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種表面有一特殊結(jié)構(gòu)——莢膜，組成一般為糖和多肽，可保護(hù)細(xì)菌不被白細(xì)胞吞噬、抵御惡劣環(huán)境、抵抗殺菌抑菌物質(zhì)損傷，即使脫離宿主，在富營(yíng)養(yǎng)化的水體中也可長(zhǎng)期存活，莢膜也可助細(xì)菌黏附于機(jī)體組織細(xì)胞，在細(xì)菌侵染宿主中起到重要作用[20-21]。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種061101對(duì)多數(shù)供試藥物不敏感，進(jìn)一步說(shuō)明了莢膜對(duì)細(xì)菌的保護(hù)作用。血清、葡萄糖、鐵離子對(duì)細(xì)菌莢膜的形成有促進(jìn)作用，在無(wú)血清等的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)數(shù)代，細(xì)菌莢膜會(huì)消失[22]，因此剛從病魚(yú)上分離出來(lái)的細(xì)菌有致病性，重復(fù)繼代培養(yǎng)后，致病性迅速下降直至消失。因此本研究在培養(yǎng)美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種061101進(jìn)行感染試驗(yàn)時(shí)，在培養(yǎng)基中加入血清，以促進(jìn)細(xì)菌莢膜產(chǎn)生，保持其致病力，但由于感染試驗(yàn)時(shí)間較短，形成的結(jié)節(jié)數(shù)量較少，直徑約在0.1 mm。生產(chǎn)上可從抑制細(xì)菌莢膜生成結(jié)合使用消毒劑來(lái)防止該病原傳播。