劉 才，王作平，楊夢婷，張中保，鄒華文，吳忠義

(1.長江大學 農(nóng)學院，湖北 荊州 434025; 2.北京市農(nóng)林科學院/北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100097)

玉米是我國第一大作物，年種植面積超3 000萬hm2[1]。玉米的高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)是糧食安全的重要保證。在玉米整個生長過程中，雜草會與其爭奪陽光、營養(yǎng)水分及生長空間，嚴重影響玉米的正常生長，造成玉米產(chǎn)量下降。同時，雜草滋生阻礙了田間通風透光,使得玉米很容易滋生病蟲害，嚴重影響玉米的產(chǎn)量及品質(zhì)[2]。為了保證單位面積上的糧食產(chǎn)量，各種除草劑相繼被開發(fā)，糧食生產(chǎn)率由此得以大幅度提高。除草劑的使用也極大地減小了勞動強度，提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平[3]。

磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑是具有代表性的乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase，ALS)抑制劑類除草劑，具有高效、低毒、廣譜、選擇性強等優(yōu)良特性?；酋ｋ孱惡瓦溥蜻惓輨┚ㄟ^抑制ALS活性，阻斷支鏈氨基酸合成而達到殺除雜草的目的，對人和哺乳動物毒性低，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用[4]。其中，苯磺隆和甲咪唑煙酸是較為常用的磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑。張金林等[5]在室內(nèi)用苯磺隆、甲磺隆和綠磺隆對玉米種子進行抑制試驗，根長測定結(jié)果表明，玉米胚根是比較敏感的試驗材料。蘇旺蒼等[6]研究了玉米不同部位對甲咪唑煙酸的敏感性，結(jié)果表明，甲咪唑煙酸對玉米根長、株高、側(cè)根及根毛數(shù)量均有抑制作用。同時，不同植物對咪唑啉酮類除草劑的耐受能力也有很大差別，耐受植物吸收此類除草劑后能依靠自身防御機制將其迅速代謝降解使其失活；非耐受植物吸收此類除草劑后反而會通過代謝產(chǎn)生有毒物質(zhì)，對植物的生長產(chǎn)生抑制[7]。

近年，有關(guān)植物ALS對磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑的抗性(耐受)機制研究多集中在雜草和少數(shù)玉米品種上，對于玉米骨干自交系A(chǔ)LS的研究報道較少。我國玉米品種繁多，弄清骨干自交系對不同濃度苯磺隆和甲咪唑煙酸這2類ALS抑制劑類除草劑的耐受差異，對于利用基因編輯技術(shù)培育抗ALS抑制劑類除草劑突變體過程中選擇合適的受體材料具有重要指導意義。為此，以7個玉米骨干自交系為研究對象，探究這2類除草劑不同濃度處理下的玉米初生根長抑制率、苗期生長抑制率和ALS活性，評價不同玉米自交系對除草劑的敏感性差異，從而選擇較敏感的自交系作為抗除草劑突變體培育過程中的受體材料。

1 材料和方法

1.1 材料

玉米骨干自交系：C92、京724、京2416、B73、鄭58、HZ178和178。

試劑：98%苯磺隆(Tribenuron-methyl)和96%甲咪唑煙酸(Imazapic)標準品(上海阿拉丁公司)；10%苯磺隆可濕性粉劑(山東勝邦綠野化學有限公司)和240 g/L甲咪唑煙酸水劑(德國巴斯夫股份有限公司)。

設(shè)備： Multiskan FC酶標儀(Thermo Scientific公司)和SPX-250智能生化培養(yǎng)箱(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同質(zhì)量濃度苯磺隆和甲咪唑煙酸對各玉米自交系初生根長的抑制試驗 參考柴建方等[8]的濾紙卷直立發(fā)芽法。將10%苯磺隆可濕性粉劑和240 g/L甲咪唑煙酸水劑用蒸餾水分別稀釋為0.05、0.25、0.50、1.00、2.00 μg/L的溶液。在1 L的玻璃燒杯中加入苯磺隆和甲咪唑煙酸不同質(zhì)量濃度梯度溶液各500 mL(空白對照加入等量蒸餾水)。精選大小一致的玉米種子，將規(guī)格25 cm×15 cm的2張發(fā)芽紙重疊，在距上部邊緣3 cm左右位置處逐層卷入6粒玉米種子，之后用橡皮筋固定，放入裝有不同質(zhì)量濃度除草劑溶液的燒杯中，每個處理重復(fù)3次，于SPX-250智能生化培養(yǎng)箱中，溫度(28±1)℃、相對濕度80%條件下暗培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后小心取出發(fā)芽材料，測量主根長，計算不同質(zhì)量濃度除草劑對根長生長的抑制率，并以抑制率概率值(y)和質(zhì)量濃度值(x)建立回歸方程(y=a+bx)，求出抑制中質(zhì)量濃度(IC50)[9]。抑制率=(對照根長-處理根長)/對照根長×100%。

1.2.2 不同質(zhì)量濃度苯磺隆和甲咪唑煙酸對各玉米自交系幼苗生長的抑制試驗 以田間劃分小區(qū)的方式，使每個小區(qū)內(nèi)種植玉米苗數(shù)相同。根據(jù)2種除草劑生產(chǎn)推薦濃度及其溶解性差異分別設(shè)置4個質(zhì)量濃度梯度，其中苯磺隆可濕性粉劑試驗施用質(zhì)量濃度分別為166、334、667、1 334 mg/L，甲咪唑煙酸水劑試驗施用質(zhì)量濃度分別為120、240、480、960 mg/L。用2 L手持壓縮式噴霧器對三葉一心期玉米莖葉均勻噴霧至表面形成液滴，對照噴施等量清水。施藥前后24 h內(nèi)無降雨，藥劑處理15 d后調(diào)查玉米苗生長受抑制情況，植株受抑制表現(xiàn)為葉片枯黃和新葉牛尾狀扭曲不能正常抽出。幼苗生長抑制率=(死亡株數(shù)+受抑制株數(shù))/小區(qū)總株數(shù)×100%。

1.2.3 不同濃度苯磺隆和甲咪唑煙酸對各玉米自交系胚芽鞘ALS活性的影響試驗 ALS的提?。簠⒄辗吨窘鸬萚10]的方法。取暗培養(yǎng)3 d的玉米胚芽鞘0.5 g，剪碎后放入4 ℃預(yù)冷的研缽中，加入1.8 mL酶提取液(含1 mmol/L丙酮酸鈉、0.5 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L TPP、10 μmol/L FAD的0.1 mol/L pH值7.0的磷酸緩沖液)和適量石英砂，冰浴條件下快速研磨勻漿，置于裝有18 mg PVPP的2 mL離心管中，迅速旋渦混勻后置于冰上，于4 ℃、20 000 g離心15 min。取上清液1.5 mL轉(zhuǎn)入干凈的2 mL離心管中，冰置備用。

標準曲線制作：分別在1.5 mL離心管中加入100 μL的100、80、60、40、20、10、5、1 nmol/mL乙偶姻溶液(以5 μL蒸餾水為空白，用于調(diào)零)，加入0.5%肌酸50 μL和5% 1-萘酚50 μL，60 ℃金屬浴顯色15 min，迅速置于冰浴中冷卻1 min后，12 000 r/min離心2 min，取上清于520 nm比色。以O(shè)D520為橫坐標、乙偶姻濃度為縱坐標制作標準曲線。

離體條件下ALS活性測定：在96孔酶標板中用排槍先加入50 μL酶液，然后加入苯磺隆和甲咪唑煙酸溶液至終濃度分別為0.05、0.5、5、50、500 nmol/L(以磷酸鉀緩沖液為對照)，再加入45 μL酶反應(yīng)液(含1 mmol/L 氯化鎂、0.1 mmol/L TPP、10 μmol/L FAD-Na2、40 mmol/L丙酮酸鈉的20 mmol/L pH值7.5的磷酸鉀緩沖液)，吸打混勻后在酶標儀上35 ℃溫育1 h。然后加入3 mol/L硫酸10 μL終止反應(yīng)，吸打混勻后在酶標儀上60 ℃脫羧15 min。最后，加入0.5%肌酸50 μL和5% 1-萘酚50 μL，吸打混勻后在酶標儀上60 ℃溫育顯色15 min，迅速置于冰浴中冷卻1 min后，2 700 g離心2 min，取上清200 μL轉(zhuǎn)入新酶標板中于520 nm比色(樣品溶液A)。每份酶液設(shè)置1個滅活樣(空白樣品A0，50 μL酶液中先加入3 mol/L硫酸10 μL，再加45 μL酶反應(yīng)液和5 μL磷酸鉀緩沖液，不進行35 ℃溫育，后續(xù)同步脫羧和顯色)。用樣品實測吸光值(A-A0)代入乙偶姻標準曲線進行線性回歸分析，計算出樣品鮮質(zhì)量的酶活性(U/mg，以每小時生成1 nmol乙酰乳酸為1個活性單位，以乙酰乳酸脫羧生成的乙偶姻進行顯色反應(yīng))。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

試驗原始數(shù)據(jù)均錄入Excel軟件后進行統(tǒng)計和計算分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度苯磺隆和甲咪唑煙酸對各玉米自交系初生根長抑制率的影響

不同質(zhì)量濃度的苯磺隆和甲咪唑煙酸對7種玉米骨干自交系的初生根長均有抑制作用，抑制效果均隨著除草劑質(zhì)量濃度的增加明顯增強(圖1和圖2)。在苯磺隆最高質(zhì)量濃度2.00 μg/L下，自交系C92的根長抑制率最高(66.4%)，自交系178的根長抑制率最低(19.5%)；在甲咪唑煙酸最高質(zhì)量濃度2.00 μg/L下，自交系C92的根長抑制率最高(80.6%)，自交系178的根長抑制率最低(32.4%)。由此可知，在相同質(zhì)量濃度下，甲咪唑煙酸對各玉米自交系的抑制效果強于苯磺隆。

苯磺隆質(zhì)量濃度/(μg/L)Tribenuron-methyl mass concentration圖1 不同質(zhì)量濃度苯磺隆對各玉米自交系初生根長抑制率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of tribenuron-methyl on the inhibition rate of primary root length of mazie inbred lines

甲咪唑煙酸質(zhì)量濃度/(μg/L)Imazapic mass concentration圖2 不同質(zhì)量濃度甲咪唑煙酸對各玉米自交系初生根長抑制率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of imazapic on the inhibition rate of primary root length of mazie inbred lines

不同玉米自交系初生根長對苯磺隆和甲咪唑煙酸的敏感性差異如表1和表2所示，在苯磺隆抑制下各自交系的IC50值為4.70～14.19 μg/L，甲咪唑煙酸抑制下各自交系的IC50值為3.70～9.57 μg/L，C92最為敏感，178耐受能力最強。根據(jù)IC50值，各自交系對2種除草劑的敏感性均為：C92>京724>京2416>B73>鄭58>HZ178>178。

表1 各玉米自交系初生根長對苯磺隆的敏感性Tab.1 Sensitivity of the primary root length of maize inbred lines to tribenuron-methyl

表2 各玉米自交系初生根長對甲咪唑煙酸的敏感性Tab.2 Sensitivity of the primary root length of maize inbred lines to imazapic

2.2 不同質(zhì)量濃度苯磺隆和甲咪唑煙酸對各玉米自交系幼苗生長抑制率的影響

如圖3所示，各自交系幼苗的生長抑制率隨著苯磺隆質(zhì)量濃度的提高而升高，但是各質(zhì)量濃度梯度的苯磺隆對自交系178和HZ178的抑制率明顯低于其他5個自交系。當苯磺隆質(zhì)量濃度為334 mg/L時，自交系C92、京724、京2416、B73和鄭58表現(xiàn)較為敏感，抑制率達到60.7%以上；178和HZ178的抑制率在11.2%～21.1%，敏感性較低。當苯磺隆質(zhì)量濃度達到667 mg/L時，178和HZ178的抑制率在21.2%～32.3%，其他5個自交系的抑制率均超過83.3%。當苯磺隆質(zhì)量濃度提高到1 334 mg/L時，178和HZ178的抑制率在30.8%～45.0%，而其他5種自交系的抑制率均達到100%。由此可見，自交系C92、京724、京2416、B73和鄭58相比178和HZ178對除草劑苯磺隆較敏感。

苯磺隆質(zhì)量濃度/(mg/L)Tribenuron-methyl mass concentration圖3 不同質(zhì)量濃度苯磺隆對各玉米自交系幼苗生長抑制率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of tribenuron-methyl on growth inhibition rate of seedlings of maize inbred lines

如圖4所示，隨著甲咪唑煙酸質(zhì)量濃度的升高，各自交系幼苗的生長抑制率逐漸增大。在甲咪唑煙酸質(zhì)量濃度為120 mg/L下，C92、京724、京2416、B73和鄭58的抑制率均在50.5%以上；而178和HZ178的抑制率在30.5%～40.0%，敏感性略低。當甲咪唑煙酸質(zhì)量濃度達到240 mg/L時，178和HZ178的抑制率在50.5%～61.9%，其他5個自交系的抑制率均大于80.5%。當甲咪唑煙酸質(zhì)量濃度為480 mg/L時，178和HZ178的抑制率約為80%，而其他5種自交系的抑制率均達到100%。在甲咪唑煙酸質(zhì)量濃度提高至960 mg/L時，7種自交系全部死亡，抑制率均達到100%。

甲咪唑煙酸質(zhì)量濃度/(mg/L)Imazapic mass concentration圖4 不同質(zhì)量濃度甲咪唑煙酸對各玉米自交系幼苗生長抑制率的影響Fig.4 Effects of different concentrations of imazapic ongrowth inhibition rate of seedlings of maize inbred lines

綜合2種除草劑在相同質(zhì)量濃度下各自交系幼苗生長的抑制率，可以推斷出不同自交系對2種除草劑的敏感性均為：C92>京724>京2416>B73>鄭58>HZ178>178。

2.3 不同濃度苯磺隆和甲咪唑煙酸對各玉米自交系胚芽鞘ALS活性的影響

隨著苯磺隆濃度升高，自交系C92、京724、京2416、B73和鄭58的ALS活性均呈現(xiàn)下降趨勢；178和HZ178在苯磺隆濃度達到0.05 nmol/L之后，ALS活性相對穩(wěn)定，其ALS活性受苯磺隆影響不明顯(圖5)。由此可見，自交系C92、京724、京2416、B73和鄭58的ALS活性相比178和HZ178對苯磺隆更敏感。

苯磺隆濃度/(nmol/L)Tribenuron-methyl concentration圖5 不同濃度苯磺隆對各玉米自交系A(chǔ)LS活性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of tribenuron-methyl on the ALS activity of maize inbred lines

如圖6所示，在甲咪唑煙酸濃度為0.05 nmol/L時，各玉米自交系胚芽鞘的ALS活性都表現(xiàn)出下降的趨勢；隨后在甲咪唑煙酸濃度升高至5 nmol/L期間，各自交系酶活性曲線波動幅度較??；當甲咪唑煙酸濃度從5 nmol/L升高至500 nmol/L期間，自交系C92、京724、京2416、B73和鄭58的ALS活性曲線顯著下降，而178和HZ178兩者酶活性曲線無明顯下降趨勢。由此推斷，在甲咪唑煙酸作為抑制劑的條件下，自交系C92、京724、京2416、B73和鄭58的ALS活性相比178和HZ178更敏感。

甲咪唑煙酸濃度/(nmol/L)Imazapic concentration圖6 不同濃度甲咪唑煙酸對各玉米自交系A(chǔ)LS活性的影響Fig.6 Effects of different concentrations of imazapic on the ALS activity of maize inbred lines

綜合圖5和圖6，2種除草劑在濃度達到500 nmol/L時，甲咪唑煙酸比苯磺隆對玉米胚芽鞘內(nèi)的ALS活性抑制作用更強，由此推斷，7種玉米骨干自交系對甲咪唑煙酸比苯磺隆敏感。

3 結(jié)論與討論

ALS抑制劑類除草劑在玉米田中主要用于防除禾本科雜草和某些闊葉雜草。目前已經(jīng)開發(fā)的ALS抑制劑類除草劑約有13類50種之多，包括磺酰脲類(Sulfonylureas,SU)、咪唑啉酮類(Imidazolinones,IMI)、嘧啶水楊酸類(Pyrimidinylthiobenzoates,PTB)、三唑并嘧啶類(Triazolopyrimidines,TP)等[11]?；酋ｋ孱惓輨┰谟衩咨a(chǎn)中應(yīng)用最多的主要是煙嘧磺隆和砜嘧磺隆，而苯磺隆的應(yīng)用多集中在小麥上[12]。咪唑啉酮類除草劑的應(yīng)用主要在大豆和花生上[12]，在玉米上的應(yīng)用未見報道。本研究應(yīng)用2種ALS抑制劑類除草劑苯磺隆和甲咪唑煙酸探討7種玉米骨干自交系的敏感性差異。初生根長抑制試驗結(jié)果表明，在苯磺隆和甲咪唑煙酸抑制下各自交系的IC50值分別在4.70～14.19 μg/L和3.70～9.57 μg/L，其中C92最為敏感，178耐受能力最強；幼苗生長抑制試驗結(jié)果顯示，各自交系幼苗的生長抑制率隨著苯磺隆和甲咪唑煙酸質(zhì)量濃度的提高而升高，但苯磺隆對自交系178和HZ178的抑制率明顯低于其他5個自交系；ALS活性試驗反映出自交系C92、京724、京2416、B73和鄭58的ALS活性相比178和HZ178,對抑制劑苯磺隆和甲咪唑煙酸更敏感。以上試驗結(jié)果表明,7個自交系對2種除草劑的敏感性均為C92>京724>京2416>B73>鄭58>HZ178>178，各自交系均對甲咪唑煙酸更敏感；自交系C92、京724和京2416相比B73、鄭58、178和HZ178均對苯磺隆及甲咪唑煙酸更加敏感，是利用基因編輯技術(shù)篩選培育抗ALS抑制劑類除草劑突變體的優(yōu)良受體材料。

自20世紀70年代以來，國內(nèi)開發(fā)出一系列超高效磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑，針對這類除草劑在實際應(yīng)用中對一些敏感作物產(chǎn)生藥害等問題，國內(nèi)外專家學者進行了大量研究。陳錫嶺等[13]發(fā)現(xiàn)，芐嘧磺隆對玉米不同品種根的生長有不同的抑制作用。謝娜等[14]發(fā)現(xiàn)，不同玉米品種對氯吡嘧磺隆的耐藥性有較大差異，其中甜玉米耐藥性最差。已有研究表明，玉米不同類型品種對煙嘧磺隆耐藥性的差異是作物的遺傳特性和所處的環(huán)境條件等因素共同作用的結(jié)果，其中作物的遺傳特性是其產(chǎn)生耐藥性的主要因素[15]。本研究通過對試驗結(jié)果的平行比較和趨勢分析發(fā)現(xiàn)，自交系對苯磺隆和甲咪唑煙酸的敏感性均依次為C92>京724>京2416>B73>鄭58>HZ178>178，同時這些材料對甲咪唑煙酸比苯磺隆更為敏感。對于C92等對ALS抑制劑類除草劑較敏感的材料，應(yīng)在生產(chǎn)中選擇合適劑量以避免發(fā)生藥害。

王煥民[16]通過研究表明，由于磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑的水溶性不同，外界條件中土壤pH值對于兩者的活性和安全性影響較大。KOEPPE等[17]指出，不同植物對磺酰脲類除草劑的耐藥性差異主要與其代謝降解速度有關(guān)。另有YOON等[18]指出，Lys255F和Lys255Q突變可以導致植物對磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑產(chǎn)生很強的抗性。對ALS抑制劑類除草劑的抗性機制可概括為：(1)除草劑在作物體內(nèi)的代謝功能提升；(2)作用靶標發(fā)生變異使除草劑毒力降低；(3)作物不同的吸收和傳導作用使到達作用部位的藥量下降[19]。本研究在生理和形態(tài)指標上初步探索了玉米不同骨干自交系對不同濃度苯磺隆和甲咪唑煙酸的耐藥性差異，對于各自交系間產(chǎn)生這些差異的原因，有待于從代謝降解途徑和ALS作用靶標等生化機制方面開展進一步的研究。