，新富，， ， ，,5

(1 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；2 青島市魚類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266071；3 青島海星儀器有限公司，山東 青島 266000；4 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械儀器研究所，上海200092；5 上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

目前國內(nèi)尚無對于石斑魚聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response,ABR)的研究報(bào)道，本研究利用自主構(gòu)建的ABR檢測系統(tǒng)對珍珠龍膽石斑魚的聽覺閾值和聽頻范圍等指標(biāo)進(jìn)行檢測，研究結(jié)果將為研究水下噪聲對石斑魚類的潛在影響以及相應(yīng)的環(huán)境優(yōu)化提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

20條體長32～35 cm的珍珠龍膽石斑魚購自煙臺養(yǎng)殖基地，每次試驗(yàn)前靜養(yǎng)2～3 d。麻醉試驗(yàn)根據(jù)相關(guān)論文[3]進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，采用背鰭基部注射加拉碘銨 (Gallamine triethiodide,購自Sigma-Aldrich公司)， 使用劑量為(1.25±0.13) μg/g 魚體質(zhì)量，對試驗(yàn)魚實(shí)施麻醉。在該劑量麻醉劑的作用下，麻醉狀態(tài)可持續(xù)2～3 h，且基本沒有全身性的肌肉收縮，排除了試驗(yàn)過程中肌電的干擾。

1.2 儀器及ABR檢測系統(tǒng)的組成

試驗(yàn)所用的ABR 檢測系統(tǒng)參照相關(guān)文獻(xiàn)[3-6]并進(jìn)行了構(gòu)建和優(yōu)化，所需儀器見表1，系統(tǒng)原理示意圖見圖1。水槽材質(zhì)為有機(jī)玻璃，尺寸為120 cm×50 cm×50 cm，水下?lián)P聲器距水面25 cm。將水槽置于防震臺上，通過固定裝置將麻醉后試驗(yàn)魚的身體基本沒于水槽水面以下，并使水位保持低于石斑魚頭蓋骨2 cm左右。在水槽中放置1臺小型循環(huán)加氧泵，通過軟管將富氧水流入魚口中，保證正常供氧。系統(tǒng)進(jìn)行檢測時(shí)，首先使用醫(yī)療紗布蘸取蒸餾水擦拭魚的頭骨皮膚3～5次，待魚表皮干燥后采用固定于防震臺上的電極操縱器(WPI M3301,WPI)，將記錄電極精準(zhǔn)定位于兩眼上頭骨中縫的聽神經(jīng)位置，參考電極定位于記錄電極前方兩眼中間的位置，兩個(gè)電極均插入皮下0.5～1 mm，記錄電極和參考電極接地后連接至生物電信號放大器(ISO-80,WPI)，在魚尾部肌肉中插入接地電極，以防止魚體肌電造成的干擾。

表1 主要試驗(yàn)儀器

圖1 ABR 檢測系統(tǒng)示意圖

1.3 參數(shù)設(shè)定

水下聲音信號由信號發(fā)生器(DG1022U，普源，中國)產(chǎn)生純短音信號，經(jīng)過前級和功率放大器(A-9030， 安橋，日本)將信號放大之后由水下?lián)P聲器給出。通過信號發(fā)生器設(shè)置聲音輸出模式，聲音信號時(shí)程根據(jù)頻率的不同設(shè)置為10～20 ms，間歇3 s，記錄時(shí)長50 ms，測試石斑魚100、200、300、500、800、1 000、1 500、2 000、3 000、5 000、10 000 Hz各頻率的AEP閾值(AEP單位為dB)。刺激信號聲強(qiáng)從高到低，以5 dB遞減，接近閾值時(shí)，每次減小2 dB，直至確定閾值。刺激聲強(qiáng)度由最高160 dB，再以5 dB依次遞減。濾波范圍為100 Hz～1 kHz，疊加1 000次[3]。聲壓水平(SPL)的校準(zhǔn)和水下背景噪聲的記錄使用水下聲音記錄儀(Soudtrap 300HF，Ocean Instruments，新西蘭)和水聽器(中船重工726所自制，型號：RST-32，工作頻率范圍：20 Hz～50 kHz，低頻接收靈敏度：≥-202.7 dB)輔助完成，使用1 μPa為水下參考聲壓，測量實(shí)際聲壓并完成修正后得到正確聲壓值。

通過放大器將石斑魚的聽覺誘發(fā)電位(AEP)，放大10 000 倍后輸入四通道24位同步數(shù)據(jù)采集卡進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換，導(dǎo)入電腦，使用采集卡配套軟件記錄數(shù)據(jù)。每個(gè)頻率、每個(gè)強(qiáng)度的試驗(yàn)過程均重復(fù)2次，以確定獲得的ABR 具有二次重復(fù)性，能夠獲得可重復(fù)ABR 波形的最小聲壓級，即為該頻率下的聽覺閾值。通過多次重復(fù)后對結(jié)果進(jìn)行平均，能夠消除單次試驗(yàn)誤差和環(huán)境噪聲信號的干擾。本研究在對試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)500次時(shí),已經(jīng)能夠得到較理想的ABR曲線，最終選擇1 000 次重復(fù)作為本研究的最終結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Clampfit 8.1軟件分析處理試驗(yàn)中記錄的ABR數(shù)據(jù),通過Sigmaplot 12.0作圖和SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS Inc.)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 珍珠龍膽石斑魚ABR 波形特點(diǎn)

共對20 尾珍珠龍膽石斑魚進(jìn)行了ABR 測試，結(jié)果顯示，20尾魚均對100 Hz～10 kHz純音有較明確的響應(yīng)，且能夠記錄到放大后的AEP。在100 Hz～10 kHz的頻率范圍內(nèi)，ABR 波形存在1個(gè)較明顯的負(fù)向主波峰和1個(gè)正向主波峰，如200 Hz 95 dB刺激下的ABR 波形(圖2)；并且在特定頻率范圍內(nèi)還會在正向主波峰后伴隨1～3個(gè)小型正向波峰(圖3)。每個(gè)AEP信號的響應(yīng)潛伏期為3～6 ms，并且響應(yīng)潛伏期的時(shí)間會隨著刺激聲強(qiáng)度的增強(qiáng)而呈現(xiàn)縮短的趨勢，每增強(qiáng)10 dB，約縮短0.1～0.3 ms，但潛伏時(shí)間對于頻率的變化并不敏感 (圖3)。對照組的死亡石斑魚在同樣聲音刺激下，沒有記錄到AEP信號。

圖2 200 Hz的珍珠龍膽石斑魚的ABR 波形

圖3 不同頻率、聲強(qiáng)刺激下的珍珠龍膽石斑魚的ABR 波形

2.2 珍珠龍膽石斑魚的ABR聽覺閾值曲線

應(yīng)用構(gòu)建的ABR檢測系統(tǒng)，20條石斑魚在100～5 000 Hz的聽頻范圍內(nèi)均記錄到短純音誘發(fā)的AEP信號，將每一頻率的閾值平均，繪制出魚在各頻率下的聽覺閾值曲線(圖4)。經(jīng)過分析，魚的最適聽頻范圍為100～2 000 Hz，最敏感的聲音頻率為300 Hz，聽覺閾值約為75.8 dB。

圖4 珍珠龍膽石斑魚聽覺閾值曲線

3 討論

3.1 魚類聽覺能力測定的方法

魚類的聽覺特性包括聽覺閾值、環(huán)境噪聲對魚類聽覺的遮蔽效果、音頻辨別能力、聲源定位能力、對學(xué)習(xí)音的記憶力等[7]。聽覺閾值是指魚類剛能聽到聲音的最小聲壓值,是魚類最基本的聽覺特性，目前對于魚類聽覺閾值進(jìn)行測定的方法主要分為行為學(xué)、電生理學(xué)和神經(jīng)電位測量3種手段。行為學(xué)研究主要是根據(jù)魚類對聲音刺激的條件反射，判斷魚類對刺激聲音的反應(yīng)以及閾值；電生理學(xué)研究是通過對魚進(jìn)行馴化,將聲音刺激和電擊相結(jié)合，使魚對刺激產(chǎn)生條件反射,然后只采用聲音刺激并根據(jù)心電圖或鰓蓋運(yùn)動的變化判斷魚對聲音的反應(yīng)；神經(jīng)電位測量則通過采集魚的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)出的動作電位，根據(jù)電位的變化判斷魚對聲音刺激的反應(yīng)，測定魚類的聽覺閾值[8]。

采集聽性腦干反應(yīng)(ABR)作為一種非侵入性的神經(jīng)電位研究方法，其原理是收集由聲音引起的第8神經(jīng)及腦干聽覺核的同步神經(jīng)電位[9-10]。ABR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是能夠?qū)崿F(xiàn)無創(chuàng)傷、快速、反復(fù)測定聽力，對試驗(yàn)魚大小無要求，能夠?qū)Σ煌N類魚類的聽覺進(jìn)行研究[4]，但是ABR技術(shù)對試驗(yàn)環(huán)境特別是電磁環(huán)境要求極其嚴(yán)格。試驗(yàn)結(jié)果還經(jīng)常會受到背景環(huán)境噪聲的干擾,在不同環(huán)境下使用不同檢測儀器時(shí)，結(jié)果往往會有所差別[3]。盡管如此，憑借非侵入性檢測手段的巨大便利，聽性腦干反應(yīng)(ABR)從1998年被應(yīng)用于魚類聽力研究以來，該技術(shù)被迅速推廣[4,11]。國內(nèi)魚類聽覺電生理研究發(fā)展較晚，目前研究水平還相對落后，該領(lǐng)域的報(bào)道還僅見于胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)、斑馬魚(Daniorerio)和褐菖鲉(Sebasticusmarmoratus)等淡水魚類[3,6,12]。

3.2 石斑魚類的聽覺閾值特征

目前,石斑魚屬魚類的聽覺研究資料十分匱乏,僅有1999年韓國科學(xué)家Yang等[13]采用心電圖(ECG)技術(shù)對七帶石斑魚(Epinephelusseptemfasciatus)的聽覺閾值進(jìn)行了研究，在100～1 000 Hz的頻率范圍內(nèi)，七帶石斑魚的聽覺曲線呈“U”形，其最佳聽覺頻率為350Hz，閾值為94.8 dB。本研究中，珍珠龍膽石斑魚的聽力曲線與報(bào)道的七帶石斑魚的聽力曲線十分相似，但最佳聽力頻率和閾值均有所不同，分析原因，可能既與試驗(yàn)魚的大小、來源等有關(guān)，也與兩項(xiàng)研究中所采用的魚類聽覺檢測技術(shù)在性能上的差異有關(guān)。根據(jù)Takahito等[14]使用聽性腦干反應(yīng)(ABR)和心電圖(ECG)技術(shù)測定鯉魚(Cyprinuscarpio)聽覺閾值的研究結(jié)果，ABR測得的最敏感頻率為505 Hz,而用ECG測得的最敏感頻率為1 000 Hz，盡管使用ABR技術(shù)和ECG技術(shù)得到的聽覺圖的形狀相似,但兩個(gè)圖中閾值水平有所不同。張旭光等[12]比較了褐菖鲉在行為聽覺和聽覺誘發(fā)電位反應(yīng)的差異，發(fā)現(xiàn)行為聽覺獲得的敏感頻率范圍為80～300 Hz，其中對100 Hz聲音最為敏感,對應(yīng)的聽覺閾值為90 dB，而ABR獲得的試驗(yàn)結(jié)果為：敏感頻率范圍100～300 Hz，其中150 Hz為最敏感頻率，對應(yīng)閾值為70 dB，行為聽覺曲線與聽覺誘發(fā)電位法所得到的褐菖鲉聽覺曲線基本相似。與鯉魚和褐菖鲉相似，本研究利用ABR技術(shù)獲得的珍珠龍膽石斑魚的最敏感聽覺頻率為300 Hz，閾值為75.8 dB，也低于采用ECG技術(shù)獲得的七帶石斑魚最佳聽覺頻率(350 Hz)和閾值(94.8 dB)的試驗(yàn)結(jié)果，以上試驗(yàn)結(jié)果能夠在一定程度上反映ABR和ECG技術(shù)的差異和各自特點(diǎn)。目前大多數(shù)魚類的ABR聽覺曲線為“U”形，如鯽魚(Carassiusauratus)[4]、橙鰭沙鰍(Botiamodesta)[15]、胭脂魚等[3]；少數(shù)魚類的ABR聽覺曲線為直線形，如地圖魚(Astronotuscellatus)[4]；極少數(shù)魚類呈現(xiàn)“W”形，如美洲鰣(Alosasapidissima)[16]。

3.3 石斑魚類的聽覺能力與其他魚類的比較

魚類的聽覺器官有兩種類型：一種與鰾不相連接；另一種與鰾相連接，使鰾成為聽覺器官的一部分，特別是鯉科魚類。有一個(gè)稱為魏勃氏器(Weberian apparatus)的器官，是由脊柱前端的數(shù)個(gè)骨所形成，借鰾連接內(nèi)耳，具有聽骨的功用。鰾壁的振動，借著魏勃氏器的傳導(dǎo)而形成具有一定頻率與強(qiáng)度的波動，再傳入魚的內(nèi)耳。通常認(rèn)為，骨鰾魚類聽覺最敏感，非骨鰾類次之,無鰾類聽覺能力較差，有鰾魚類相比無鰾魚類具有更寬的聽頻范圍和更低的聽力閾值[6]。因此，可以認(rèn)為鰾不僅使魚類聽覺敏銳，也扮演著擴(kuò)大聲音頻率范圍的角色[17]。劉猛等[3]研究發(fā)現(xiàn)，胭脂魚的聽頻范圍為100～5 000 Hz,100～2 000 Hz范圍敏感度較高,800 Hz最敏感,聽覺閾值約69.8 dB。Kenyon等[4]研究發(fā)現(xiàn)金魚(Carassiusauratus)的聽頻范圍為100～5 000 Hz，最低閾值為64.0 dB。鰱(Hypopthalmichthysmolitrix)和鳙(Aristichthysnobilis)的聽頻范圍為100～3 000 Hz，鰱的最低閾值為104.2 dB,鳙的最低閾值為105.7 dB[18]。石斑魚類作為一種有鰾魚類，其聽頻范圍為100～5 000 Hz,最適聽頻范圍為100～2 000 Hz，這一范圍基本與大多數(shù)魚類的聽覺頻率接近，屬于低頻聲響。有鰾的杜父魚(Pseudoblenniuscottoides)的聽頻范圍為40～6 000 Hz，而Mann等[16,19]研究發(fā)現(xiàn)鯡形目的美洲鰣(Alosasapidissima)和大鱗油鯡(Brevoortiapatronus)甚至可以聽到高達(dá)180 kHz的超聲波。底棲無鰾的牙鲆(Paralichthysolivacues)則對60～200 Hz 的低頻音較敏感，最敏感頻率為100 Hz，其聽覺閾值為(94±1.5) dB[20]。而沒有韋伯氏器的魚類,如鱸形目魚類，蝦虎魚(Gobiuscruentatus) 閾值均高于108 dB，而且聽頻范圍窄,不超過1 000 Hz[21]。

3.4 麻醉劑對魚類ABR研究結(jié)果的影響

在檢測魚類腦干電信號的過程中，使用不同類型的麻醉劑以及不同劑量會對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。潘豪來等[6]采用0.01%和0.1%的三卡因甲基磺酸鹽(MS-222)對斑馬魚進(jìn)行短暫麻醉和深度麻醉后，應(yīng)用AEP檢測系統(tǒng)記錄不同時(shí)間點(diǎn)的AEP，結(jié)果表明，過度麻醉會導(dǎo)致響應(yīng)波形潛伏期延長、幅值下降，相反，麻醉程度變淺后所記錄的斑馬魚響應(yīng)波形潛伏期縮短、幅值升高。而Kenyon等[4]發(fā)現(xiàn)使用加拉碘銨作為麻醉劑不會對金魚ABR產(chǎn)生影響。Yan等[22]、Cordova等[23]的研究也證實(shí)使用加拉碘銨作為麻醉劑不會對魚類的ABR產(chǎn)生影響。根據(jù)以上研究報(bào)道，本試驗(yàn)中也將加拉碘銨作為珍珠龍膽石斑魚的麻醉劑，并根據(jù)魚體質(zhì)量和預(yù)試結(jié)果對使用的劑量進(jìn)行優(yōu)化，也為今后開展更大規(guī)格石斑魚以及其他大型海洋游泳性魚類的麻醉劑劑量使用提供參考。

4 結(jié)論

石斑魚是中國沿海養(yǎng)殖的高值魚類代表，屬于趨觸性巖礁魚類，喜棲息于魚礁孔隙中，特別的生活習(xí)性使其既適合于工廠化高密度養(yǎng)殖，也適合于人工魚礁增殖。隨著近年來石斑魚人工繁殖和養(yǎng)殖技術(shù)的突破，石斑魚養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，池塘、網(wǎng)箱、陸海接力、工廠化循環(huán)水、深遠(yuǎn)海養(yǎng)殖工船等養(yǎng)殖模式不斷涌現(xiàn)。本研究建立的珍珠龍膽石斑魚聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測系統(tǒng)和初步獲取的聽覺閾值，以及珍珠龍膽石斑魚的聽性腦干反應(yīng)(ABR)聽覺曲線能夠?yàn)檠芯吭肼晫Σ煌B(yǎng)殖模式下石斑魚的動物福利提供重要的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，在下一步研究中還需要對ABR檢測系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，提高檢測系統(tǒng)的抗干擾能力和穩(wěn)定性。與此同時(shí)，也需要對不同體型和不同生長階段的石斑魚進(jìn)行研究，如石斑魚苗種和親魚等，以更好地評估噪聲對養(yǎng)殖石斑魚健康生長的影響。

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