倪 璠，柯 陽(yáng)，鄒仁超，艾潤(rùn)垚，馬瑞成，周 劍，郭志唐，王 琳※

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科，昆明 650101； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明 650500)

肝細(xì)胞癌是全球癌癥發(fā)病率排名第六位，癌癥致死人數(shù)排名第四位的惡性腫瘤[1]。目前早期肝細(xì)胞癌的治療主要以外科手術(shù)切除為首選[2]，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差。因此，探索抑制肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找更有效安全治療藥物是當(dāng)務(wù)之急。黑升麻為毛茛科植物，廣泛生長(zhǎng)于歐洲、北美及亞洲。其傳統(tǒng)藥用部分為根及莖，其中主要成分為兩大類(lèi)化合物三萜糖苷和苯丙素類(lèi)。美國(guó)原住民一直將其用作解熱鎮(zhèn)痛、抗炎劑[3]。1820年被載入《美國(guó)藥典》，黑升麻用于治療圍絕經(jīng)期綜合征已有100多年歷史，而相關(guān)研究普遍認(rèn)為其體內(nèi)作用機(jī)制異于雌激素[4-5]。大量實(shí)驗(yàn)表明黑升麻提取物不僅不會(huì)增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[6]，反而對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用[7-11]。而在體外實(shí)驗(yàn)中，給予Spragne-Dawley雌性小鼠口服高濃度黑升麻提取物可有效降低小鼠乳腺癌的發(fā)生率[12]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，三萜糖苷中的Actein對(duì)膠質(zhì)瘤、胃癌、膀胱癌、前列腺癌等腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)同樣具有抑制作用[13-17]。本研究擬探討黑升麻提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2增殖和凋亡的影響，期待發(fā)現(xiàn)新的抗肝細(xì)胞癌藥物。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)藥物和細(xì)胞株 黑升麻提取物(三萜皂苷含量8%)S27368-100 g購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。HepG2(人肝癌細(xì)胞)購(gòu)自昆明動(dòng)物所。

1.1.2主要試劑及儀器 DMEM/F12(dulbecco′s modified eagle medium/F12)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗、谷氨酰胺、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting Kit-8，CCK-8)、Annexin V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-fluoresceine isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海東仁化學(xué)公司；RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液，二辛可寧酸蛋白濃度測(cè)定試劑盒，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(5X)購(gòu)自中國(guó)碧云天公司。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液顯色液購(gòu)于美國(guó)Millipore公司，麗春紅染色液、牛血清白蛋白購(gòu)于北京索萊寶公司。內(nèi)參一抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)購(gòu)自中國(guó)Abmart公司。檢測(cè)二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記通用型二抗購(gòu)于美國(guó)CST公司。丙烯酰胺、SDS、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、四甲基乙二胺均購(gòu)于美國(guó)Sigma/Amresco公司。蛋白酶抑制劑Phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF)、磷酸化蛋白酶抑制劑購(gòu)自瑞士Roche公司。儀器：恒溫干燥箱(日本SANYO公司)，自動(dòng)消毒鍋(日本SANYO公司)，-80 ℃超低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司)，掌上離心機(jī)(中國(guó)白鴿公司)，低溫離心機(jī)HITACH(日本CF-16RX公司)，全波長(zhǎng)分光光度計(jì)(上海UNICO公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，凝膠成像儀、垂直電泳槽、濕式轉(zhuǎn)膜槽(美國(guó)BIO-RAD公司)，封口機(jī)(中國(guó)上海麥爾多公司)，靜音混合儀(中國(guó)其林貝爾公司)，Whatman濾紙(3 mm)(美國(guó)GE公司)，高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo scientific公司)，流式細(xì)胞儀(德國(guó)Parc Gmbh，CyFlow Space公司)，CO2培養(yǎng)箱(中國(guó)力康生物公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞用DMEM/F12+10%胎牛血清+1%雙抗+1%谷氨酰胺，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每?jī)商靷鞔淮?，取?duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2黑升麻提取物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 黑升麻提取物用二甲基亞砜配制成50 mg/mL的儲(chǔ)存液，4 ℃冰箱避光保存。接種HepG2細(xì)胞至96孔板內(nèi)，每孔接種5 000個(gè)細(xì)胞，按以下實(shí)驗(yàn)條件分組并更換培養(yǎng)基：空白孔(加含30 μg/mL黑升麻提取物的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，未接種細(xì)胞)、黑升麻藥物濃度0、10、20、30、40、50 μg/mL組的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每組3個(gè)孔重復(fù)，每孔液體量為100 μL。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h(5% CO2，37 ℃)，每個(gè)孔加入10 μL的CCK-8試劑，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，收集數(shù)據(jù)，計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組-空白孔)/(對(duì)照組-空白孔)×100%。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黑升麻提取物對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響 接種HepG2細(xì)胞至6孔板內(nèi)，每孔接種105個(gè)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含黑升麻0、10、20、32 μg/mL的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基。磷酸緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞2次，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基終止消化。以離心半徑8 cm，1 000 r/min離心3 min，棄上清。加入磷酸緩沖鹽溶液后1 000 r/min離心3 min，棄上清(重復(fù)該步驟兩遍)。加入200 μL Annexin V Binding Buffer，重懸細(xì)胞，隨機(jī)取100 μL細(xì)胞懸液，加入新的1.5 mL離心管中，向細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC結(jié)合物，5 μL的碘化丙啶。室溫下避光染色15 min，每管加入900 μL磷酸緩沖鹽溶液，加樣到流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4Western blot檢測(cè)Cleaved caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白的表達(dá) 向黑升麻0、10、20、32 μg/mL組細(xì)胞6孔板中分別加入100 μL的RIPA裂解液(含1 μL蛋白酶抑制劑)，冰浴上裂解15 min，細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞收集到1.5 mL離心管中，低溫高速離心機(jī)中離心(4 ℃，12 000 r/min,離心半徑10 cm)加入100 μL SDS上樣緩沖液，93 ℃水浴10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)二辛可寧酸試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整各個(gè)樣品的蛋白上樣量為80 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜膜上，將聚偏二氟乙烯膜膜置于5%的牛血清白蛋白中，室溫(20～30 ℃)封閉1.5 h，脫色，吸干牛血清白蛋白液，加入一抗2 mL，4 ℃冰箱中過(guò)夜。去除一抗后TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。加入酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色液顯色處理后，暗室中曝光。

2 結(jié) 果

2.1黑升麻提取物抑制HepG2細(xì)胞增殖 各組抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)意義(F=139.300,P<0.05),隨著各組給藥濃度的增加抑制率逐漸升高(P<0.05)，存活率逐漸降低。黑升麻IC50為32.010 μg/mL。見(jiàn)表1。

組 別實(shí)驗(yàn)孔OD值抑制率(%)存活率(%)0 μg/mL組3.16±0.09010010 μg/mL組1.29±0.0212.51±9.31a87.49±9.3120 μg/mL組1.09±0.0727.85±1.51ab72.15±1.5130 μg/mL組0.75±0.0553.20±5.55abc46.80±5.5540 μg/mL組0.57±0.0367.42±3.54abcd32.58±3.5450 μg/mL組0.38±0.0181.43±0.73abcde18.57±0.73

a與0 μg/mL組比較，P<0.05；b與10 μg/mL組比較，P<0.05；c與20 μg/mL組比較，P<0.05；d與30 μg/mL組比較，P<0.05；e與40 μg/mL組比較，P<0.05

2.2黑升麻提取物促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞經(jīng)Annexin-V-FIFC/PI雙染后，與0 μg/mL組相比，10 μg/mL組、20 μg/mL組、32 μg/mL組早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞所占百分比明顯增加，且隨著黑升麻提取物給藥濃度的增加，凋亡細(xì)胞所占百分比明顯增加，見(jiàn)圖1A、1B、1C、1D。HepG2細(xì)胞系中，黑升麻提取物10、20、32 μg/mL給藥濃度處理后凋亡細(xì)胞百分比與0 μg/mL組對(duì)比顯著增高(P<0.05),見(jiàn)圖1E。

2.3黑升麻提取物促進(jìn)HepG2細(xì)胞Cleaved caspase-3、8、9蛋白表達(dá) HepG2細(xì)胞中，與0 μg/mL組比較，20、32 μg/mL組Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與0 μg/mL組比較，32 μg/mL組Cleaved caspase-8蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；HepG2細(xì)胞中，不同藥物濃度處理后Cleaved capase-9蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

3 討 論

黑升麻根莖被德國(guó)E委員會(huì)批準(zhǔn)為治療經(jīng)前期綜合征和絕經(jīng)綜合征的自主神經(jīng)癥狀的非處方藥，含其主要成分的產(chǎn)品臨床研究已被美國(guó)草藥典收錄，相應(yīng)的市售藥品名為莉芙敏片[18]。相較于更年期綜合征的傳統(tǒng)激素療法，尚未見(jiàn)黑升麻相關(guān)藥品有增加乳腺癌、心血管疾病、卒中風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)報(bào)道，而目前認(rèn)為其相應(yīng)作用機(jī)制主要與選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)、5-羥色胺通路調(diào)節(jié)機(jī)制，抗氧化作用、炎癥反應(yīng)等相關(guān)[4]?，F(xiàn)普遍認(rèn)為黑升麻作用機(jī)制異于雌、孕、雄激素，亦不同于植物激素。有實(shí)驗(yàn)支持黑升麻在癌癥患者中的應(yīng)用是安全的，對(duì)于乳腺癌、前列腺癌等激素依賴(lài)性腫瘤細(xì)胞具有抗增殖作用[19]。因此，基于已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為探求新的抗腫瘤藥物，本研究主要探究黑升麻對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響及可能的作用機(jī)制。

1A：10 μg/mL組；1B、1C、1D分別為10、20、32 μg/mL濃度的黑升麻提取物處理48 h后人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞凋亡比率；1E:流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)凋亡細(xì)胞數(shù)據(jù)分析；*與0 μg/mL組比較，P<0.05；#與10 μg/mL組比較，P<0.05；△與20 μg/mL組比較，P<0.05

圖1黑升麻提取物處理HepG2細(xì)胞48h后凋亡檢測(cè)

2A：Western blot凝膠圖像(Cleaved caspase-3蛋白檢測(cè)過(guò)程出現(xiàn)兩條印跡是caspase-3活化時(shí)被剪切成19 000和17 000的兩個(gè)小蛋白，取19 000條帶檢測(cè)灰度值)； 2B、2C、2D分別為Cleaved caspase-3、8、9在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)情況及分析[GAPDH(abmart m20006)為內(nèi)參，Image J灰度掃描，計(jì)算各組相對(duì)灰度值]；*與0 μg/mL組比較，P<0.05

圖2黑升麻提取物促進(jìn)HepG2細(xì)胞Cleavedcaspase-3、8、9蛋白表達(dá)

腫瘤細(xì)胞是通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)外過(guò)度表達(dá)抗凋亡因子，使平衡朝向自身生存，對(duì)細(xì)胞凋亡抵抗，從而導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)控制的喪失[20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑升麻可以抑制HepG2增殖，促進(jìn)HepG2凋亡。有研究顯示，黑升麻單體Actein可以抑制在膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞和U251細(xì)胞集落形成，增加促凋亡因子Bax、caspase-3和caspase-9片段以及多聚合酶1的表達(dá)，減少抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)，其相關(guān)的生物學(xué)活性基礎(chǔ)可能是觸發(fā)線(xiàn)粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路[13]。在胃癌SNU-216、AGS細(xì)胞系體外實(shí)驗(yàn)和異種移植至小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，Actein可以聯(lián)合腫瘤壞死相關(guān)凋亡誘導(dǎo)酶，并增強(qiáng)對(duì)該酶不敏感的胃癌細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死相關(guān)凋亡誘導(dǎo)酶的敏感性，從而上調(diào)p53中誘導(dǎo)受體1和2，下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2家族中的Bcl-2、Mcl-1的表達(dá)從而誘導(dǎo)線(xiàn)粒體凋亡[14]。膀胱癌BIU-87、T24、T739、5637細(xì)胞系的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Actein可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞在細(xì)胞周期G2/M生長(zhǎng)停滯，伴隨自噬小體形成，自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3B-Ⅱ集聚，caspase-3、caspase-8、caspase-9均被活化切割，研究者認(rèn)為相關(guān)機(jī)制可能是Actein抑制蛋白激酶B和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路，激活c-Jun氨基端激酶磷酸化引起腫瘤細(xì)胞凋亡自噬[15]。在給予二乙基亞硝胺誘導(dǎo)產(chǎn)生早期肝癌的C45B2/6小鼠靜脈注射Actein，發(fā)現(xiàn)其可有效緩解肝臟組織纖維變性，減輕炎癥反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)肝損傷，下調(diào)血清中甲胎蛋白的表達(dá)，相關(guān)機(jī)制可能是抑制Hedgehog信號(hào)通路，促進(jìn)p53信號(hào)通路作用[16]。而黑升麻的單體BN0-1055已被證明在前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、PC3、DU145中，BNO-1055可以通過(guò)抑制補(bǔ)救合成途徑對(duì)細(xì)胞外核苷的吸收從而抗腫瘤細(xì)胞增殖，而該部分作用被認(rèn)為主要與BNO-1055削弱了核苷平衡轉(zhuǎn)移蛋白依賴(lài)轉(zhuǎn)移體作用相關(guān)[17]。但目前對(duì)于黑升麻及其單體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制尚未完全闡明。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)黑升麻促進(jìn)HepG2細(xì)胞caspase-8、caspase-3蛋白酶原激活切割，但未促進(jìn)caspase-9片段形成。caspase-8是死亡受體通路下游的啟動(dòng)凋亡程序酶[21]，當(dāng)腫瘤壞死因子R1、Fas、死亡受體4/5等死亡受體與相應(yīng)受體結(jié)合形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體時(shí)，細(xì)胞凋亡的外在途徑就會(huì)被激活[22]。caspase-3是由CASP3基因編碼的，外部死亡受體途徑和內(nèi)在線(xiàn)粒體途徑啟動(dòng)后共同的效應(yīng)酶，在凋亡肝癌細(xì)胞中明顯表達(dá)[23]。而caspase-9由CASP9基因編碼的凋亡啟動(dòng)蛋白酶，通過(guò)磷酸化進(jìn)行調(diào)控激活，引發(fā)線(xiàn)粒體內(nèi)部活化凋亡途徑。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是癌癥治療中細(xì)胞死亡的首選模式[24]，是癌癥治療關(guān)鍵。因此,進(jìn)一步明確黑升麻提取物是否引起死亡受體通路上游受體的過(guò)表達(dá)及具體相應(yīng)的信號(hào)通路將成為后續(xù)研究重點(diǎn)。其次，黑升麻提取物對(duì)正常肝細(xì)胞毒性也需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，黑升麻提取物能夠抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，其機(jī)制可能與caspase-8介導(dǎo)的外源性死亡受體途徑相關(guān)。黑升麻具有潛在的抗癌作用，但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。