蔣 明，朱 欣，楊如棉，鄔張穎，應(yīng)夢(mèng)豪，馬佳瑩，王佳怡，張慧娟

(臺(tái)州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000)

芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌隸屬于芽孢桿菌科，廣泛分布于自然界，種類十分豐富，在《芽孢桿菌文獻(xiàn)研究》中記載了244種，并不斷有新種發(fā)現(xiàn)的報(bào)道[1-4]。常見的芽孢桿菌屬細(xì)菌包括巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformus)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(B.firmus)、側(cè)孢芽孢桿菌(B.laterosporus)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)等，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品及環(huán)保等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[5-8]。其中，枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，芽孢呈橢圓至圓柱狀，能還原硝酸鹽，是一種好氧細(xì)菌[5]。枯草芽孢桿菌的應(yīng)用和研究已有100多年的歷史，在農(nóng)業(yè)上，枯草芽孢桿菌常用作植物病害的生防菌[9]?？莶菅挎邨U菌V26用于防治由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的馬鈴薯黑絲菌病，具有良好的生防效果[9]；枯草芽孢桿菌HK-CSM-1防治人參炭疽病(Colletotrichumpanacicol)具有很好的效果[10]。

細(xì)菌鑒定的方法有形態(tài)學(xué)、生理生化和分子鑒定等，形態(tài)學(xué)和生理生化反映細(xì)菌的表型性狀，易受外界環(huán)境及菌體生理狀態(tài)的影響，而分子鑒定則不受內(nèi)外環(huán)境的干擾，鑒定結(jié)果更具科學(xué)性和重演性[11]。5S rDNA、23S rDNA和16S rDNA是細(xì)菌核糖體的3個(gè)編碼基因，其中，16S rDNA由于長度適中，兼有保守區(qū)和可變區(qū)，能提供足夠的多態(tài)性，目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的分子鑒定和分類研究[12-15]。16S序列在枯草芽孢桿菌的鑒定上也有應(yīng)用，LOTFY W A等[16]利用16S結(jié)合形態(tài)和生化鑒定，鑒定出一株產(chǎn)鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的枯草芽孢桿菌；SUBBA REDDY GANGIREDDYGARI等[17]從土壤中分離到一株可降解有機(jī)磷殺蟲劑喹硫磷的細(xì)菌，經(jīng)測(cè)定16S DNA序列，鑒定為枯草芽孢桿菌。臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室前期從甘藍(lán)健康植株中分離到一株內(nèi)生細(xì)菌GL06，經(jīng)形態(tài)和生理生化鑒定，初步判斷為枯草芽孢桿菌，該菌對(duì)根腫菌有一定的防治效果。筆者以枯草芽孢桿菌GL06為材料，利用PCR法克隆16S序列，并比對(duì)分析，以期為后續(xù)研究該菌的功能和開展生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌GL06，為甘藍(lán)內(nèi)生菌，該菌分離自甘藍(lán)健康植株的葉柄組織，經(jīng)鑒定后保存于臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，該菌革蘭氏染色呈陽性，菌體桿狀，無莢膜，能產(chǎn)生柱狀芽孢；菌落表面粗糙，邊緣不規(guī)則。細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。DNA凝膠回收試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 用細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒提取枯草芽孢桿菌GL06的DNA，操作根據(jù)其提供的說明書進(jìn)行。DNA經(jīng)電泳檢測(cè)后，置于-20℃保存。

1.2.2 16S rDNA序列的克隆 采用PCR法克隆枯草芽孢桿菌16S rDNA序列，上、下游引物分別為5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′(27F)和5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(1492R)。PCR反應(yīng)體系20 μL：10×PCR緩沖液2 μL，模板DNA 20 ng，dNTPs(10 mM)0.45 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.25 μL，TaqDNA聚合酶0.4 μL，加ddH2O至終體積。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 變性30 s，55.5℃退火45 s，72℃延伸2 min，共32個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的回收、連接和轉(zhuǎn)化 PCR擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳。用潔凈的刀片割取含目的條帶的膠塊，置于1.5 mL無菌離心管中，用DNA凝膠回收試劑盒回收DNA片段。取3 μL回收產(chǎn)物與2×Rapid Ligation Buffer 5 μL、pGEM-T Easy載體(Promega)1 μL和T4DNA連接酶1 μL混合，置于4℃連接過夜。用熱激法導(dǎo)入Trans5α感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。經(jīng)涂布平板，挑取白色單菌落于37℃振蕩培養(yǎng)12 h，經(jīng)菌液PCR鑒定后，挑取3個(gè)陽性克隆用于測(cè)序。菌液PCR反應(yīng)體系與程序同16S rDNA序列的克隆，模板DNA改為0.5 μL菌液。

1.2.4 16S rDNA序列比對(duì)分析 序列相似性比較在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行，從NCBI數(shù)據(jù)庫下載10種芽孢桿菌屬細(xì)菌的16S序列，分別是凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)(KJ148634.1)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)(NR_043401.1)、細(xì)胞毒素芽孢桿菌(B.cytotoxicus)(NR_074914.1)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)(NR_041455.1)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)(NR_043403.1)、韋氏芽孢桿菌(B.weihenstephanensis)(NR_024697.1)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)(NR_074540.1)、環(huán)狀桿菌(B.circulans)(EU733231.1)、簡單芽孢桿菌(B.simplex)(NR_042136.1)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)(NR_112116.2)。去除兩段多余序列后用Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹方法為鄰接法。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA序列的克隆

以27F和1492R為上、下游引物，從枯草芽孢桿菌GL06基因組DNA中擴(kuò)增到16S序列。該片段的大小約1 500 bp，條帶清晰、單一，無明顯的雜帶(圖1)。經(jīng)割膠、回收后，得到高純度的回收產(chǎn)物，用于與載體的連接。

注：M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～4為枯草芽孢桿菌GL06基因組16S rDNA的PCR產(chǎn)物。Note: M,DNA marker; 1-4,PCR products of 16S rDNA in genome of B. subtilis strain GL06.

2.2 序列比對(duì)

經(jīng)測(cè)序，3個(gè)陽性克隆的16S rDNA序列完全一致，長度均為1 510 bp(圖2)。GL06 16S序列中A、T、C、G的比例分別是24%、22%、31%和23%，GC值為54%。該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中枯草芽孢桿菌(NR_112116.2)16S序列的相似性最高，達(dá)99%，僅存在3個(gè)堿基差異；與解淀粉芽孢桿菌(NR_041455.1)的相似性次之，達(dá)98%；與其余芽孢桿菌屬的相似性為93%～94%。

經(jīng)多序列比對(duì)，GL06 16S與其他16S相比，序列上存在插入/缺失及轉(zhuǎn)換和顛換現(xiàn)象。與環(huán)狀桿菌16S相比，GL06 16S在46位存在插入現(xiàn)象；與巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、韋氏芽孢桿菌和細(xì)胞毒素芽孢桿菌的16S相比，在47位存在1個(gè)堿基缺失；與巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、韋氏芽孢桿菌和細(xì)胞毒素芽孢桿菌比較，GL06 16S在3位存在C?T轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，在48位發(fā)現(xiàn)A?T顛換(圖3)。11條序列中，共有201個(gè)可變位點(diǎn)(Variable site)，其中，簡約性信息位點(diǎn)(Parsimony-informative site)135個(gè)，單態(tài)突變位點(diǎn)(Singleton variable site)66個(gè)。

注：單下劃線為上游引物27F，雙下劃線為引物1492R的反向互補(bǔ)序列。Note: Single underline,forward primer 27F; Double underline,reverse complement sequence of primer 1492R.

圖3 枯草芽孢桿菌GL06及其同源序列的多重比對(duì)Fig.3 Multiple comparison in 16S rDNA sequence between B. subtilis strain GL06 and its homologous sequences

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹

芽孢桿菌屬11個(gè)菌株總的遺傳距離為0.055，GL06與枯草芽孢桿菌的遺傳距離最小，僅0.001；與簡單芽孢桿菌的遺傳距離最大，為0.070。從圖4看出，11個(gè)菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹上可分為4組，GL06與枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌聚于組IV，支持率為100%；蘇云金芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和韋氏芽孢桿菌處于同一分支，再與細(xì)胞毒素芽孢桿菌聚于組I，支持率為100%；環(huán)狀桿菌、簡單芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌聚于組Ⅱ；凝結(jié)芽孢桿菌單獨(dú)位于組Ⅲ。

3 結(jié)論與討論

目前，細(xì)菌的鑒定方主要有傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察、血清型鑒定、毒力測(cè)試、生化測(cè)定、儀器自動(dòng)化鑒定和分子鑒定等[18]。分子鑒定方法有GC含量測(cè)定、DNA-DNA分子雜交、指紋圖譜和16S序列分析等，此外，RNA 聚合酶的σ因子(rpoD)基因和促旋酶B亞基(gryase，gryB)基因在細(xì)菌分類和檢測(cè)中也有一定應(yīng)用[19-20]。rpoD、gryB等持家基因具有較快的進(jìn)化速率，不同物種間的序列差異顯著，而且分辨能力高，目前已應(yīng)用于細(xì)菌的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究[21-23]。盛強(qiáng)等[20]利用16S、gryB和rpoD等對(duì)辣椒(Capsicumannuum)一種新的細(xì)菌性葉斑病病原菌進(jìn)行了鑒定，初步判定為黃褐假單胞菌(Pseudomonasfulva)；盧佳琦等[24]結(jié)合16S和gryB對(duì)一株從凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)活菌片中分離的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，該菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列相似性達(dá)100%，明確該菌株為蠟樣芽孢桿菌。

在分子鑒定方法中，對(duì)16S序列進(jìn)行克隆、測(cè)序和比對(duì)，是目前鑒定細(xì)菌最為常用的方法。利用引物27F和1492R可擴(kuò)增出約1 500 bp的片段，該序列具高度保守、中度保守和高度可變化的區(qū)域，可用來研究進(jìn)化距離不同的細(xì)菌之間的關(guān)系和鑒定[25-26]。本研究利用通用引物從一株甘藍(lán)內(nèi)生枯草芽孢桿菌中克隆到長度為1 510 bp的片段，其序列大小與NCBI數(shù)據(jù)庫中枯草芽孢桿菌(NR_112116.2)完全一致，但在序列組成上存在個(gè)別堿基的差異。BOSSHARD P P等[27]研究認(rèn)為，相似率>99%可定義為種，結(jié)合前期的形態(tài)學(xué)和生化鑒定結(jié)果，確定GL06是枯草芽孢桿菌。陳美琪等[28]從健康鱸魚中分離出一株細(xì)菌，其16S rDNA基因序列與枯草芽孢桿菌的相似性達(dá)99%，因此確定該種為枯草芽孢桿菌。呂美云等[29]從豆豉中分離到5株產(chǎn)纖溶酶的細(xì)菌，通過測(cè)定16S序列，其中，有2株與枯草芽孢桿菌的相似性達(dá)99%，認(rèn)定2株細(xì)菌為枯草芽孢桿菌。同屬細(xì)菌之間的16S序列通常十分接近，一般認(rèn)為，16S rDNA相似性為95%～99%可確定為同屬，但GL06菌株除與枯草芽孢桿菌(NR_112116.2)和解淀粉芽孢桿菌(NR_041455.1)外，與其余8種芽孢桿菌屬菌株間的相似性低于這個(gè)范圍，與嚴(yán)婉榮等[30]的研究結(jié)果一致。

以甘藍(lán)內(nèi)生菌枯草芽孢桿菌GL06為材料，利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得該菌的16S rDNA。GL06菌株16S序列的GC含量為54%，與來自NCBI數(shù)據(jù)庫的枯草芽孢桿菌16S相似性高達(dá)99%，僅存在3個(gè)堿基的差異。芽孢桿菌屬11個(gè)菌株(GL06、凝結(jié)芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、細(xì)胞毒素芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、韋氏芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、環(huán)狀桿菌、簡單芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌)在發(fā)育樹上可分為4組，其中，GL06與枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌聚為一組。甘藍(lán)內(nèi)生枯草芽孢桿菌GL06菌株16S rDNA的克隆與序列分析，為后續(xù)該菌的功能研究和生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。