鄭君杰，方芳，孫志偉，賈濤，李征，何月新

（北京市飼料監(jiān)察所，北京 100107）

黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）是多種霉菌（如黃曲霉和寄生曲霉）產(chǎn)生的有毒代謝物，是人類癌癥的一個(gè)重要致癌原。至今已分離出的黃曲霉毒素及其衍生物有20多種，自然界中主要包含四種亞型（黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2）。動(dòng)物進(jìn)食發(fā)霉飼料后，黃曲霉毒素一部分蓄積在動(dòng)物體內(nèi)，另一部分則會(huì)轉(zhuǎn)化到乳汁和尿液中，轉(zhuǎn)化率一般為3.45%～11.39%，排出AFM1的量為AFB1攝入量的1%～3%[1]。黃曲霉毒素B1可通過(guò)羥基化轉(zhuǎn)化為黃曲霉毒素M1，因此牛奶中就會(huì)含有黃曲霉毒素M1，目前各毒素亞型已知毒性大小順序?yàn)锳FB1＞AFM1＞AFG1＞AFB2＞AFG2[2]。黃曲霉毒素M1相對(duì)穩(wěn)定，常規(guī)處理方法如巴氏殺菌不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響，因此如果生鮮乳中存在黃曲霉毒素M1，其終端產(chǎn)品中也將存在，所以很多國(guó)家對(duì)乳及乳制品中黃曲霉毒素M1含量進(jìn)行了限制。

本試驗(yàn)使用熒光定量檢測(cè)卡及高通量實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)儀測(cè)定生鮮乳中黃曲霉毒素M1含量，檢測(cè)原理是以熒光素作為發(fā)光物質(zhì)來(lái)標(biāo)記抗體，檢測(cè)樣本中相應(yīng)的目標(biāo)物。熒光定量檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，已經(jīng)在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[3]。通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助半抗原合理設(shè)計(jì)，采用雜交瘤、熒光標(biāo)記等技術(shù)，獲得了熒光定量快速檢測(cè)卡，檢測(cè)卡中的硝酸纖維素膜（NC）含有固定于測(cè)試區(qū)（T）的包被抗原、控制區(qū)（C）的多克隆抗體和固定于結(jié)合釋放墊上的熒光素標(biāo)記抗體。當(dāng)將待測(cè)樣品滴加在加樣區(qū)時(shí)，樣品中的目標(biāo)物在毛細(xì)滲移過(guò)程中與熒光素標(biāo)記的特異性單克隆抗體結(jié)合，抑制了抗體和T區(qū)包被抗原的結(jié)合，使T區(qū)熒光減弱；反之，T區(qū)熒光增強(qiáng)。采用熒光讀數(shù)儀讀取T線熒光強(qiáng)度，借助儀器內(nèi)置的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出樣品中目標(biāo)物含量。

1 材料和方法

1.1 材料

黃曲霉毒素M1熒光定量檢測(cè)卡。

1.2 儀器

微量移液器；計(jì)時(shí)器；熒光免疫定量分析儀（北京維德維康生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：FQ-S1）。

1.3 樣品的制備

空白樣品：生鮮乳。

添加樣品：向空白樣品加入黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品至所需濃度。

表1 空白樣品測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表 單位：μg/L

表2 準(zhǔn)確度和精密度

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 最低檢測(cè)限測(cè)定

取20份空白樣品，按照黃曲霉毒素M1熒光定量檢測(cè)卡操作說(shuō)明書方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出其平均值，再加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差，即為最低檢測(cè)限。

1.4.2 準(zhǔn)確度和精密度

準(zhǔn)確度是指測(cè)定值與真實(shí)值的符合程度。取空白生鮮乳樣品按0.05μg/L、0.1μg/L黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加，每個(gè)添加5個(gè)平行，使用黃曲霉毒素M1熒光定量檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3 與儀器方法比較

采用黃曲霉毒素M1熒光定量檢測(cè)卡和高效液相色譜法分別對(duì)50份生鮮乳盲樣進(jìn)行測(cè)定，比較測(cè)定結(jié)果，以檢測(cè)限作為陰陽(yáng)性判定值。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低檢測(cè)限測(cè)定

結(jié)果表明，計(jì)算出的最低檢測(cè)限為0.047 μg/L（表1）。為保障產(chǎn)品的穩(wěn)定性，將黃曲霉毒素M1熒光定量檢測(cè)卡在生鮮乳中的檢測(cè)限定為0.05μg/L。

2.2 準(zhǔn)確度和精密度

用3個(gè)批次的檢測(cè)卡測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，所有樣品各添加濃度的回收率均在90.00%～110.00%之間。各添加濃度的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均低于15%。

2.3 與儀器方法比較

表3 與儀器方法比較結(jié)果 單位：μg/L

用該黃曲霉毒素M1熒光定量檢測(cè)卡和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素M族的測(cè)定》（GB5009.24-2016）第二法[4]分別對(duì)50份生鮮乳盲樣進(jìn)行測(cè)定，比較測(cè)定結(jié)果，以檢測(cè)限作為陰陽(yáng)性判定值。小于黃曲霉毒素M1熒光定量檢測(cè)卡檢測(cè)限的檢測(cè)結(jié)果記為“-”，儀器結(jié)果記為“ND”；大于黃曲霉毒素M1熒光定量檢測(cè)卡檢測(cè)限的以實(shí)際檢測(cè)值表示（表3）。結(jié)果顯示，二者的符合率為100%。

3 討論

因?yàn)樯r乳貯存條件特殊，不宜長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸貯存，所以快速檢測(cè)方法對(duì)生鮮乳質(zhì)量監(jiān)測(cè)具有重要意義，尤其是現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，可以提高工作效率，加大監(jiān)測(cè)范圍和力度，保證生鮮乳及乳制品質(zhì)量安全。目前實(shí)驗(yàn)室常用的快速檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）和膠體金法。ELISA法可以定量但對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求比較高，適合大批量樣品同時(shí)檢測(cè)；膠體金法快捷簡(jiǎn)便，但一般用于定性。這些方法均不能很好地滿足在奶站和奶車現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)、養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)個(gè)別奶牛連續(xù)監(jiān)測(cè)等方面的要求。而本文所采用的熒光定量檢測(cè)法具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：①試驗(yàn)所需儀器設(shè)備少，只需要一臺(tái)配套熒光定量檢測(cè)儀即可，不需要離心機(jī)等多個(gè)輔助設(shè)備；②操作時(shí)間短，高通量實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)儀在15min內(nèi)即可完成檢測(cè)；③少量、大批量樣品篩查均適合，一次可以做1～10個(gè)樣品，可根據(jù)樣品量使用檢測(cè)卡，節(jié)省檢測(cè)成本，后續(xù)還可以進(jìn)行數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)上傳；④檢測(cè)卡可常溫保存，沒(méi)有酶標(biāo)物、抗體、底物等材料，對(duì)保存條件要求低；⑤可以準(zhǔn)確定量。

黃曲霉毒素M1熒光定量檢測(cè)卡在生鮮乳中的檢測(cè)限為0.05μg/L，農(nóng)業(yè)部近兩年在全國(guó)生鮮乳專項(xiàng)監(jiān)測(cè)計(jì)劃中，要求快速方法的檢出限為不高于0.05μ g/kg。大多數(shù)國(guó)家都對(duì)食品或飼料中黃曲霉毒素含量進(jìn)行了限制，如歐盟將牛奶和奶粉復(fù)原乳中黃曲霉毒素M1限量規(guī)定為0.05μ g/L或50ppt，嬰幼兒配方奶粉和嬰兒醫(yī)用特殊食品中的限量值為0.025μg/kg；我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素安全限量》（GB2761-2017）中規(guī)定乳及乳制品中黃曲霉毒素M1限量值為0.5μg/kg；美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局（FDA）和日本規(guī)定的牛奶中黃曲霉毒素M1限量值也為0.5μg/kg[5]。從以上數(shù)據(jù)可以看出，熒光定量檢測(cè)卡在生鮮乳中黃曲霉素素M1快速篩查中，其檢測(cè)限能夠滿足我們國(guó)家專項(xiàng)監(jiān)測(cè)要求，同時(shí)低于或等于大多數(shù)國(guó)家安全限量值，也能夠滿足相關(guān)乳企質(zhì)量安全檢測(cè)要求。

2016年，武瑞霞等[6]就國(guó)內(nèi)外乳及乳制品黃曲霉毒素M1污染問(wèn)題進(jìn)行了綜述，認(rèn)為乳及乳制品中黃曲霉毒素M1污染仍是一個(gè)全球尚未解決的問(wèn)題，污染程度在地理分布上，總趨勢(shì)是從內(nèi)陸向沿海、自北向南增高。我國(guó)是個(gè)乳品消費(fèi)大國(guó)，因此對(duì)生鮮乳中黃曲霉毒素M1的控制更應(yīng)該加強(qiáng)。本研究使用熒光定量檢測(cè)卡檢測(cè)黃曲霉毒素M1，各添加濃度回收率均在90.00%～110.00%之間；各添加濃度批內(nèi)、批間變異系數(shù)均低于15%；黃曲霉毒素M1熒光定量檢測(cè)卡和儀器法盲樣測(cè)定符合率為100%。通過(guò)添加、盲樣測(cè)定、與儀器方法比較等試驗(yàn)，表明該方法簡(jiǎn)便快捷、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以用于生鮮乳檢測(cè)機(jī)構(gòu)及奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)、奶站、奶車的現(xiàn)場(chǎng)黃曲霉毒素M1快速檢測(cè)。