王曉華，李 輝，李 俊，楊 旭

1)云南省第二人民醫(yī)院產(chǎn)科 昆明 650021 2)云南省第二人民醫(yī)院婦科 昆明 650021 3)云南省第二人民醫(yī)院心血管病中心 昆明 650021

惡性腫瘤是一個(gè)世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題。子宮內(nèi)膜癌為常見的上皮性惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制與癌基因、抑癌基因異常表達(dá)有關(guān)，研究其發(fā)病機(jī)制對(duì)于腫瘤治療具有重要意義[1]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silence information regulator 1,SIRT1)屬于Sirtuin蛋白家族成員，是酵母沉默信號(hào)調(diào)節(jié)因子2在人體組織中的類似物，在人體多種組織和器官中均有表達(dá)，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、炎癥、新陳代謝等病理生理過程[2-3]。SIRT1在人鱗狀上皮細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌等腫瘤組織中高表達(dá)，參與癌細(xì)胞生長(zhǎng)過程[4-5]。目前已經(jīng)有報(bào)道[6]顯示，SIRT1在子宮內(nèi)膜癌組織中的陽(yáng)性率高于正常子宮內(nèi)膜組織，SIRT1在子宮內(nèi)膜癌中可能發(fā)揮癌基因的作用。本研究探討下調(diào)SIRT1對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，為靶向治療子宮內(nèi)膜癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司。SIRT1 shRNA重組慢病毒和陰性對(duì)照shRNA慢病毒由北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建?；罨腃aspase-3(Cleaved Caspase-3)抗體、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein, CHOP)抗體購(gòu)自美國(guó)Abbkine公司，活化的轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)抗體購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司，細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)抗體、P21抗體購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，SIRT1抗體購(gòu)自上海安妍生物有限公司，山羊抗HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，PrimeScript RT reagent Kit購(gòu)自TaKaRa公司，SYBR Green Real-time PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組Ishikawa細(xì)胞分為空白對(duì)照組、干擾組和陰性對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，同時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加青鏈霉素雙抗?？瞻讓?duì)照組不處理，干擾組和陰性對(duì)照組細(xì)胞分別感染SIRT1 shRNA和陰性對(duì)照shRNA慢病毒，MOI=30，在熒光顯微鏡下觀察其感染效率高于85%。

1.3qRT-PCR測(cè)定SIRT1mRNA的表達(dá)取3組細(xì)胞，Trizol法抽提RNA，以PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列為：SIRT1 上游 5’-CTTGCCTCATCTGCATTTT-3’，下游 5’-ATT AGGCCAGCATTTTCTCA-3’；GAPDH上游 5’-AG GTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’， 下游 5’-CGCTCCT GGAAGATGGTGAT-3’。反應(yīng)程序：90 ℃ 30 s；95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。用SYBR Green Real-time PCR試劑盒對(duì)SIRT1表達(dá)水平進(jìn)行定量，以GAPDH作為參照，依照2-ΔΔCt法計(jì)算SIRT1 mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，下同。

1.4Westernblot測(cè)定SIRT1蛋白的表達(dá)取3組細(xì)胞，以RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。每孔上樣50 μg蛋白，上樣前加入等體積2×Loading buffer煮沸5 min，設(shè)置積層膠中90 V電壓電泳，分離膠中120 V電壓電泳，電泳2.5 h。將蛋白在200 mA恒流條件下轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白室溫封閉120 min后，加1∶600稀釋后的SIRT1抗體于4 ℃條件下孵育10 h，加1∶2 000稀釋后的二抗在室溫中孵育約2 h。用ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光后顯影。以軟件Quantity One分析SIRT1、GAPDH條帶的灰度值，SIRT1蛋白表達(dá)水平=SIRT1條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.5MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖3組細(xì)胞接種于96孔板(每孔約3 000個(gè)細(xì)胞)，培養(yǎng)48 h后，添加MTT(每孔20 μL)，37 ℃結(jié)合反應(yīng)3 h。移液槍吸除上清后，每孔添加100 μL DMSO反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm的吸光度值，設(shè)空白對(duì)照組細(xì)胞的存活率為100%，分析各組細(xì)胞存活率的變化。

1.6PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期取3組細(xì)胞，以胰蛋白酶消化配制成單細(xì)胞懸液，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇固定后，添加PI染液(終濃度為50 mg/L)，300目尼龍網(wǎng)過濾，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.7AnnexinV-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡取3組細(xì)胞，以PBS洗2次，加胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，在細(xì)胞中添加400 μL的結(jié)合緩沖液，再依次添加Annexin V-FITC、PI各5 μL，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，上機(jī)檢測(cè)前再添加100 μL的結(jié)合緩沖液。

1.8Westernblot檢測(cè)細(xì)胞中CleavedCaspase-3、CHOP、ATF6、CyclinD1、P21蛋白表達(dá)水平用Western blot檢測(cè)3組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、CHOP、ATF6、Cyclin D1、P21蛋白水平(Cleaved Caspase-3一抗按1∶800稀釋，余均按1∶1 000稀釋)，具體步驟同1.4。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)，用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較陰性對(duì)照組和干擾組存活率的差異，用單因素方差分析比較3組間其他指標(biāo)的差異，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平及增殖能力的比較結(jié)果見圖1和表1。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，感染SIRT1 shRNA慢病毒的細(xì)胞(干擾組)SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，提示成功構(gòu)建了SIRT1表達(dá)下調(diào)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞模型。下調(diào)SIRT1后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖能力降低。

組別SIRT1 mRNASIRT1蛋白存活率/%空白對(duì)照組1.00±0.090.45±0.06-陰性對(duì)照組0.98±0.120.48±0.09101.45±10.23干擾組0.36±0.04?0.25±0.03?61.52±7.86?F/t74.47511.16727.734P<0.0010.010<0.001

*:與其他2組比較，P<0.05

2.2 3組細(xì)胞周期分布及相關(guān)因子表達(dá)的比較結(jié)果見圖2和表2。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，干擾組G0/G1期細(xì)胞比例升高，S期細(xì)胞比例下降，細(xì)胞中Cyclin D1蛋白表達(dá)水平降低，P21蛋白表達(dá)水平升高。

1～3：分別為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和干擾組

組別細(xì)胞周期/%G0/G1SG2/MCyclin D1P21空白對(duì)照組50.51±4.1221.66±5.2327.83±2.480.64±0.090.51±0.07陰性對(duì)照組52.18±5.1320.95±4.1626.87±3.200.62±0.080.45±0.08干擾組65.63±4.71?8.36±1.05?26.01±3.640.30±0.06?0.69±0.09?F9.44611.0110.25218.0997.237P0.0140.0100.7850.0030.025

*:與其他2組比較，P<0.05

2.3 3組細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較結(jié)果見圖3和表3。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，干擾組凋亡率升高，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、CHOP、ATF6蛋白表達(dá)水平升高。

1～3：分別為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和干擾組

組別凋亡率/%Cleaved Caspase-3CHOPATF6空白對(duì)照組2.10±0.370.28±0.030.32±0.040.26±0.04陰性對(duì)照組2.41±0.650.27±0.050.33±0.070.28±0.06干擾組16.59±1.28?0.45±0.06?0.67±0.08?0.39±0.04?F280.59613.15727.6986.485P<0.0010.0060.0010.032

*:與其他2組比較，P<0.05

3 討論

SIRT1是一種依賴輔酶Ⅰ的組蛋白脫乙酰蛋白酶，其可以通過組蛋白H1上的賴氨酸殘基K26、組蛋白H4上賴氨酸殘基K16、組蛋白H3上賴氨酸殘基K9的脫乙?；瘜?duì)組蛋白進(jìn)行修飾，能夠調(diào)控細(xì)胞衰老、神經(jīng)保護(hù)、細(xì)胞生長(zhǎng)等相關(guān)蛋白的表達(dá)[7-9]。SIRT1在淋巴瘤、前列腺癌、膀胱癌等腫瘤組織中高表達(dá)，并且可以調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[10-13]。已有研究[14]顯示，SIRT1在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)，可能在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮癌基因的作用。本實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)SIRT1后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖能力降低，提示下調(diào)SIRT1可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

細(xì)胞周期有序進(jìn)展是細(xì)胞生長(zhǎng)的基礎(chǔ)。一個(gè)完整的細(xì)胞周期是指從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)束。G0/G1期向S期進(jìn)展是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)，受細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的共同調(diào)控，其中Cyclin D1是促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)控因子，其在G0/G1期合成水平升高。而P21可以抑制Cyclin D1蛋白功能，阻礙細(xì)胞從G0/G1期向S期進(jìn)展[15-17]。研究[18-19]顯示，沉默SIRT1可以將前列腺癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期。本實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)SIRT1后，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中Cyclin D1蛋白表達(dá)水平降低，P21表達(dá)水平升高，G0/G1期細(xì)胞比例升高，說明下調(diào)SIRT1能夠?qū)⒆訉m內(nèi)膜癌細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。

凋亡是重要的細(xì)胞生物學(xué)特性，受細(xì)胞內(nèi)一系列基因的調(diào)控。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是近年來發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的機(jī)制，缺氧、氧化應(yīng)激、藥物等都可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這些刺激因素可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞漿與胞核之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[20]。ATF6是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穿膜蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)可以迅速被活化，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件基因如CHOP等的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生[21]。Caspase-3是Caspase凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游執(zhí)行因子，以酶原的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，只有被活化后才能夠發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[22]。多個(gè)研究[23-24]顯示，SIRT1發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用與減輕細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，目前在心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等細(xì)胞中已經(jīng)證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)SIRT1可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞中ATF6、CHOP表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞中活化的Caspase-3蛋白表達(dá)，提示下調(diào)SIRT1可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，SIRT1可能在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮癌基因作用，靶向SIRT1可能是治療子宮內(nèi)膜癌的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)未對(duì)其具體的靶向調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)在體內(nèi)和體外進(jìn)行更深入的探討。