陶 健，王小龍

0 引言

參麥顆粒收載于中藥成方制劑第十三冊(cè)，由山藥、枸杞子、麥冬、紅參、南沙參、黃精等6味藥材加工而成，具有養(yǎng)陰生津的功效，主要用于面黃肌瘦、津少口渴、腰膝酸軟、食欲不振、頭暈眼花，心悸氣短、神經(jīng)衰弱等疾病的治療[1]。中成藥復(fù)方制劑所含有效成分復(fù)雜，中藥材質(zhì)量因產(chǎn)地、采收季節(jié)、加工方法等因素的影響，導(dǎo)致中成藥復(fù)方制劑不同批次間存在較大質(zhì)量差異，提高中成藥復(fù)方制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)迫在眉睫。近年來(lái)多成分質(zhì)量控制已逐步應(yīng)用于中成藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制中，參麥顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)方中任何成分進(jìn)行定量研究，也未檢索到對(duì)本品中任一成分進(jìn)行定量檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道，難以有效控制參麥顆粒的質(zhì)量均一性和療效一致性。本文采用HPLC波長(zhǎng)切換技術(shù)，對(duì)參麥顆粒中主要成分山藥所含主要活性成分尿囊素，枸杞子所含活性成分原兒茶醛、兒茶素和表兒茶素，麥冬所含活性成分麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B進(jìn)行了同時(shí)測(cè)定研究，所建立的方法操作便捷、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為參麥顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)安捷倫科技公司)；AE200S型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；KQ-50型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器廠)。

1.2 試藥與試劑 參麥顆粒(規(guī)格：每袋裝25 g，批號(hào)：201711001、201712001、201801003)來(lái)源于李時(shí)珍醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；尿囊素對(duì)照品(111501-200202，含量100.0%)、原兒茶醛對(duì)照品(110810-201608，含量99.3%)、兒茶素對(duì)照品(110877-201604，含量99.2%)、表兒茶素對(duì)照品(110878-200102，含量99.7%)來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；麥冬甲基黃烷酮A對(duì)照品(74805-92-8，含量98.0%)和甲基麥冬二氫高異黃酮B對(duì)照品(74805-91-7，含量98.0%)來(lái)源于上海純優(yōu)生物科技有限公司；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.5%冰醋酸溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，17.0%A；10～16 min，17.0%A→23.0%A；16～31 min，23.0%A→49.0%A；31～42 min，49.0%A→63.0%A；42～50 min，63.0%A→17.0%A)；0～16 min時(shí)在224 nm[2-3]波長(zhǎng)下檢測(cè)尿囊素，16～31 min在280 nm[4-5]波長(zhǎng)下檢測(cè)原兒茶醛、兒茶素和表兒茶素，31～50 min時(shí)在296 nm[6]波長(zhǎng)下檢測(cè)麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B；體積流量：0.9 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl；理論塔板數(shù)按照所測(cè)各色譜峰計(jì)均不低于3 500，所測(cè)成分尿囊素、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B均能達(dá)到有效分離，分離度>1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取尿囊素、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B對(duì)照品各適量，分置6個(gè)量瓶中，用50%甲醇制成尿囊素0.774 mg/ml、原兒茶醛0.258 mg/ml、兒茶素0.146 mg/ml、表兒茶素0.312 mg/ml、麥冬甲基黃烷酮A 0.238 mg/ml、甲基麥冬二氫高異黃酮B 0.172 mg/ml的單成分標(biāo)準(zhǔn)品溶液；依次精密吸取各單成分標(biāo)準(zhǔn)品溶液2.5 ml，置同一50 ml量瓶中，用50%甲醇制成尿囊素38.7 μg/ml、原兒茶醛12.9 μg/ml、兒茶素7.3 μg/ml、表兒茶素15.6 μg/ml、麥冬甲基黃烷酮A 11.9 μg/ml、甲基麥冬二氫高異黃酮B 8.6 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 參麥顆粒供試品溶液 取參麥顆粒適量，研細(xì)，取約3.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 ml，密塞，稱定重量，KQ-50型超聲波清洗器超聲提取30 min，放冷，擦干外壁，用50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過(guò)濾，制成參麥顆粒供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照參麥顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的處方和制法，分別制備缺山藥、缺枸杞子和缺麥冬的3個(gè)陰性樣品，再按照“2.2.2”項(xiàng)下參麥顆粒供試品溶液制備方法制成山藥陰性樣品溶液、枸杞子陰性樣品溶液和麥冬陰性樣品溶液。

2.3 陰性干擾試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液、參麥顆粒供試品溶液、山藥陰性樣品溶液、枸杞子陰性樣品溶液和麥冬陰性樣品溶液各適量，依法進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示，陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下單成分標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml，分置于6個(gè)20 ml量瓶中，用50%甲醇制成25倍濃度差的6個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定尿囊素、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B的峰面積，以所測(cè)各成分質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，尿囊素、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B的峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，結(jié)果見表1。

2.5 精密度考察 取“2.2.1”項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依法進(jìn)樣連續(xù)測(cè)定6次，記錄尿囊素、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B的峰面積，結(jié)果所測(cè)各成分尿囊素、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B的峰面積的RSD分別為0.77%、1.15%、1.30%、0.91%、1.17%、1.62%。

圖1 參麥顆粒HPLC色譜圖

注：A.混合標(biāo)準(zhǔn)品(Mixed reference)，B.參麥顆粒樣品(Sample of Shenmai granule)，C.山藥陰性樣品(Sample negative ofdioscoreaerhizoma)，D.枸杞子陰性樣品(Sample negative oflyciifructus)，E.麥冬陰性樣品(Sample negative ofophiopogonisradix)。1.尿囊素(Allantoin)，2.原兒茶醛(Protocatechuic aldehyde)，3.兒茶素[(+)-catechin]，4.表兒茶素(L-epicatechin)，5.麥冬甲基黃烷酮A(Methylophiopog onanone A)，6.甲基麥冬二氫高異黃酮B(Methylophiopogonanone B)

表1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性考察 取參麥顆粒樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下參麥顆粒供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄尿囊素、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B的峰面積，計(jì)算所測(cè)各成分含量，結(jié)果尿囊素、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B含量的RSD分別為1.27%、1.38%、0.79%、1.41%、1.74%、0.88%。

2.7 穩(wěn)定性考察 取參麥顆粒樣品的同一份供試品溶液為考察對(duì)象，于室溫下0 h、2 h、4 h、6 h、10 h、16 h依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄尿囊素、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B的峰面積，結(jié)果參麥顆粒供試品溶液室溫下16 h內(nèi)穩(wěn)定，尿囊素、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B峰面積的RSD分別為0.83%、1.18%、1.25%、0.97%、1.21%、1.46%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的參麥顆粒樣品適量，研細(xì)，取6份，每份約1.5 g，精密稱定，分置不同的具塞錐形瓶中，分別精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(尿囊素0.439 mg/ml、原兒茶醛0.136 mg/ml、兒茶素0.083 mg/ml、表兒茶素0.175 mg/ml、麥冬甲基黃烷酮A 0.137 mg/ml、甲基麥冬二氫高異黃酮B 0.092 mg/ml)1.0 ml，再按照“2.2.2”項(xiàng)下參麥顆粒供試品溶液制備方法制備加樣回收樣品試液，依法進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算尿囊素、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B的回收率及RSD值，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 樣品含量測(cè)定

取3批參麥顆粒樣品(批號(hào)：201711001、201712001、201801003)各適量，按照“2.2.2”項(xiàng)下參麥顆粒供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄所測(cè)各成分尿囊素、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B的峰面積，計(jì)算所測(cè)各成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 含量測(cè)定結(jié)果(n=3，μg/g)

4 討論

4.1 流動(dòng)相選擇的考察 在流動(dòng)相的選擇過(guò)程中，筆者首先考察了甲醇-水流動(dòng)相體系[3]和乙腈-水流動(dòng)相體系[5-8]，結(jié)果顯示，乙腈-水流動(dòng)相體系優(yōu)于甲醇-水流動(dòng)相體系，但所測(cè)成分原兒茶醛、兒茶素分離效果欠佳，尿囊素色譜峰存在拖尾現(xiàn)象；在此研究基礎(chǔ)上，筆者對(duì)流動(dòng)相中水相(0.5%冰醋酸溶液[4]、0.5%磷酸溶液)進(jìn)行了對(duì)比考察，同時(shí)采用梯度洗脫技術(shù)，對(duì)梯度洗脫中流動(dòng)相的比例進(jìn)行了不斷摸索，最終確定以乙腈-0.5%冰醋酸溶液為流動(dòng)相，按照文中“2.1”項(xiàng)下的洗脫比例對(duì)參麥顆粒中的尿囊素、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B進(jìn)行同步測(cè)定。結(jié)果顯示，在此流動(dòng)相體系條件下，色譜圖基線平穩(wěn)，所測(cè)各成分尿囊素、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B均能達(dá)到有效分離。

4.2 參麥顆粒供試品溶液制備方法的考察 筆者首先對(duì)比考察了不同提取溶劑(甲醇[6-8]、50%甲醇[4-5]、乙醇、20%乙醇[3])對(duì)所測(cè)成分尿囊素、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B提取效率的影響，結(jié)果顯示，以50%甲醇為提取溶劑時(shí)，所測(cè)各成分的綜合提取效果最佳；在此研究基礎(chǔ)上，分別考察了不同提取方式(超聲提取[2-3,5-8]、加熱回流提取)對(duì)所測(cè)各成分提取率的影響，同時(shí)對(duì)提取時(shí)間(20 min、30 min、40 min)進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，最終選擇50%甲醇超聲提取30 min作為參麥顆粒供試品溶液的最佳制備方法。

本文所建立的HPLC波長(zhǎng)切換法可同時(shí)測(cè)定參麥顆粒中尿囊素、原兒茶醛、兒茶素、表兒茶素、麥冬甲基黃烷酮A和甲基麥冬二氫高異黃酮B含量，操作簡(jiǎn)單快速，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高，可以為參麥顆粒的質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支持。