羅顯鋒，董曉斐，屈 波

（1．湖南中醫(yī)藥大學(xué)2018級(jí)碩士研究生，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2．湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007；3．湖南中醫(yī)藥大學(xué)組織胚胎學(xué)研室，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為臨床表現(xiàn)的疾病［1］。呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytia Virus，RSV）是人類呼吸道感染的重要病原體之一，其感染與哮喘的發(fā)病、加重存在明顯的相關(guān)性，是引起兒童哮喘常見的病原體［2］。TLR4（Toll-like receptor 4，TLR4）為Toll樣受體家族中的一員，能識(shí)別細(xì)菌、病毒和環(huán)境中相應(yīng)抗原的保守結(jié)構(gòu)，從而啟動(dòng)天然免疫和調(diào)節(jié)性免疫應(yīng)答，在細(xì)胞活化信號(hào)的傳導(dǎo)中起重要作用［3］。TLR4廣泛存在于氣道上皮、單核/巨噬和嗜酸性粒等細(xì)胞中。TLR4的特異性配體是雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA），RSV在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中可產(chǎn)生大量dsRNA，因此RSV可作為TLR4的配體。當(dāng)支氣管上皮細(xì)胞受到RSV感染時(shí)，TLR4與dsRNA結(jié)合，可經(jīng)由MyD88依賴性或非MyD88依賴性途徑使核因子-κB（NF-κB）迅速移位于細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、IL-6、IFN-γ、TNF-ɑ、ICAM-1等炎性因子，導(dǎo)致氣道炎癥的發(fā)生［4］。

經(jīng)多年的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用，咳喘寧口服液治療病毒誘發(fā)兒童哮喘有較好療效［5］。本實(shí)驗(yàn)通過RSV懸液滴鼻感染結(jié)合OVA霧化吸入的方法建立哮喘豚鼠模型，通過對(duì)比不同組別豚鼠肺組織TLR4及NF-κB mRNA表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步探究咳喘寧口服液在支氣管哮喘治療中所發(fā)揮的作用機(jī)制。

1 材 料

動(dòng)物。清潔級(jí)豚鼠60只，雌雄各30只，體質(zhì)量250±50g，購(gòu)于湖北天勤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2014-0010。

藥品及試劑?？却瓕幙诜海ㄖ寺辄S、杏仁、桃仁、大青葉、黃芪、生石膏、細(xì)茶和甘草，每瓶100mL，每毫升含生藥1.0g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供）RSV病毒懸液（武漢東新陽生物技術(shù)有限公司），卵清白蛋白（Solarbio公司），DEPC水（大連美侖生物科技有限公司），TRIzol（Thermo公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司），擴(kuò)增試劑盒（Takara公司）。引物由上海生工生物工程有限公司合成，TLR4上游引物5'-TAGACGTGCAACGAGAAGGG-3'，下游引物5'-CCAAGGAAGGAGTACAGCCC-3'；NF-κB上游引物5'-GCCCAGCCTTACTCGACTTT-3'，下游引物5'-AAGCTCACGTCCAGACACTG-3'；β-actin上游引物5'-GATCTGGCACCACACCTTCT-3'，下游引物5-CATCTTCTCACGGTTGGCCT-3'。其余試劑為市售分析純?cè)噭?/p>

主要儀器及設(shè)備。石蠟切片機(jī)（型號(hào)Finesse 325，由英國(guó)Shando公司提供），分光光度計(jì)（由英國(guó)BioDrop公司提供），普通PCR儀（由美國(guó)Bio-Rad公司提供），熒光定量PCR儀（型號(hào)Realplex2，由德國(guó)艾本德公司提供），高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（型號(hào)Z23HK，由德國(guó)HermLe公司提供）。

2 方 法

模型的制備及分組。清潔級(jí)豚鼠60只，體質(zhì)量（250±50）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取10只作為空白組，余下50只按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法復(fù)制RSV誘發(fā)的哮喘［6］：用滴度為1.0×106空斑形成單位的RSV懸液250μL滴鼻，第2日相同劑量加強(qiáng)1次。第7日開始給予1g/mL OVA隔天霧化吸人，每次30min，持續(xù)2周，當(dāng)豚鼠出現(xiàn)噴嚏、鼻腔有少量卡他樣無色透明分泌物、弓肩聳背、點(diǎn)頭樣呼吸、腹肌抽搐、甚至站立不穩(wěn)時(shí)即為哮喘急性發(fā)作，提示造模成功。造模成功后將50只豚鼠按隨機(jī)數(shù)字法平均分為模型組，咳喘寧高、中、低劑量組，西藥對(duì)照組，每組10只。

給藥。各組均從造模2周后開始霧化治療，霧化時(shí)間均為7天，每天霧化2次，每次20min?？却瓕幗M以咳喘寧口服液霧化，設(shè)置低、中、高劑量組，每次劑量分別為0.4g/kg、0.8g/kg、1.2g/kg將其加蒸餾水使霧化總量均為20mL。西藥對(duì)照組以地塞米松和利巴韋林霧化吸入，利巴韋林劑量為0.45mg/kg，地塞米松劑量為0.7mg/kg，溶于蒸餾水使霧化總量均為20mL。模型組及空白對(duì)照組以等量蒸餾水霧化吸入。霧化治療時(shí)間均為7天，在治療過程中，模型組豚鼠死亡4只，咳喘寧中劑量組豚鼠死亡2只，咳喘寧低劑量及西藥對(duì)照組豚鼠各死亡1只，咳喘寧高劑量組及空白對(duì)照組豚鼠無死亡，所有動(dòng)物在霧化治療7天后處死取材。

取材。末次激發(fā)24h后予10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉并處死，取出其肺組織并分離左右肺。左肺放入4%多聚甲醛中固定，右肺放入凍存管中，-80℃保存。

病理檢測(cè)。取出4%多聚甲醛中固定好的肺組織，切成0.5cm×0.5cm×0.2cm大小的切塊，進(jìn)行脫水、包埋、切片，采用HE染色法染色后以中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察豚鼠肺組織的形態(tài)學(xué)變化。

豚鼠肺組織TLR4及NF-κBmRNA水平測(cè)定：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TLR4及NF-κBmRNA的表達(dá)水平。①RNA提?。杭羧〖s100 mg的豚鼠肺組織，在液氮研磨成碎片狀，并加入1 mL TRizol裂解組織，然后離心去除未完全裂解的組織；加入0.2 mL氯仿，離心，取上清液；加入0.5 mL異丙醇，棄上清液；加0.1mL 75%乙醇清洗，棄上清液，重復(fù)2～3次；室溫放置5～10 min，使沉淀物干燥后，加10～25μL DEPC水，-80℃保存。②RT反應(yīng)：1～5μg RNA、10μmol/L Oligo（dT） 1μL、DEPC水補(bǔ)足至12μL，點(diǎn)動(dòng)離心；在水浴鍋上65℃加熱5 min，冰浴3 min；加5×反應(yīng)緩沖液4.0μL、10 mmol/L dNTP Mix 2μL、RiboLock? RNA酶抑制劑 1μL，RevertAid? M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，PCR儀上42℃加熱60 min，70℃ 5min；上述反應(yīng)液即為cDNA，-80℃保存。③PCR反應(yīng)：cDNA作為熒光定量模板，使用TB Green試劑盒，按照說明書配制反應(yīng)液，在熒光定量PCR儀上設(shè)置反應(yīng)模式：95℃ 3min預(yù)變性、95℃ 10s、58℃ 30s、68℃ 20s循環(huán)40次，再加入溶解曲線后結(jié)束。讀取Ct值并分析結(jié)果。

3 結(jié) 果

各組豚鼠肺組織病理變化。正常組豚鼠肺組織無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管結(jié)構(gòu)基本完整，管壁無明顯增厚。模型組豚鼠支氣管結(jié)構(gòu)明顯紊亂，管壁明顯增厚，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。藥物治療組豚鼠肺組織病理變化均有所改善，其中西藥對(duì)照組及咳喘寧高、中劑量組改善程度優(yōu)于咳喘寧低劑量組（見圖1）。

圖1 6組豚鼠肺組織HE染色（200×）

各組豚鼠肺組織TLR4及NF-κBmRNA的表達(dá)變化。與空白對(duì)照組比較，模型組豚鼠肺組織中TLR4及NF-κBmRNA的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥對(duì)照組及咳喘寧治療組豚鼠肺組織TLR4及NF-κBmRNA的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），其中西藥對(duì)照組、咳喘寧高、中劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 各組豚鼠肺組織TLR4及NF-κBmRNA的表達(dá)量變化 （±s）

表1 各組豚鼠肺組織TLR4及NF-κBmRNA的表達(dá)量變化 （±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 例 TLR4 NF-κB空白對(duì)照組 6 1.01±0.01 1.01±0.01模型組 6 1.12±0.10* 1.12±0.10*西藥對(duì)照組 6 1.03±0.03△△ 1.02±0.02△△咳喘寧高劑量組 6 1.01±0.02△△ 1.02±0.03△△咳喘寧中劑量組 6 1.03±0.02△△ 1.02±0.02△△咳喘寧低劑量組 6 1.04±0.04△ 1.03±0.01△F 2.954 3.369 P 0.045 0.029

4 討 論

氣道慢性炎癥是哮喘基本的病理特征，TLR4是一種主要的天然免疫模式識(shí)別受體，在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中起重要作用。TLR4在識(shí)別多種病原微生物的病原相關(guān)分子模式（ PAMPs） 后可激活TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過MyD88依賴性或非 MyD88 依賴性信號(hào)途徑，解除NF-κB的抑制狀態(tài)［7］。而NF-κB是一種重要的、多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，在調(diào)控、轉(zhuǎn)錄細(xì)胞因子與促炎基因的表達(dá)中起到重要作用。NF-κB被激活后，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)誘導(dǎo)特定部位的炎性因子基因的表達(dá)，激活I(lǐng)L-1、IL-5、IL-6、IL-8、IL-13、IFN-γ、TNF-α、ICAM-1等各種炎性介質(zhì)的表達(dá)，并導(dǎo)致IgE的升高［8］。同時(shí)，激活的NF-κB可反過來促進(jìn)TLR4的表達(dá)，形成相互促進(jìn)的正反饋循環(huán)［9］。因此，當(dāng)人體呼吸道受到RSV感染時(shí)，TLR4/NF-κB信號(hào)通路可被激活，使氣道上皮產(chǎn)生大量的炎癥因子、趨化因子，從而導(dǎo)致氣道炎癥、氣道高反應(yīng)和氣道黏液高分泌，引起支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展。

支氣管哮喘屬中醫(yī)“哮喘”范疇。《丹溪心法·喘論》首次提出了“哮喘”之名，并提出“哮喘專主于痰”。中醫(yī)認(rèn)為，哮喘的發(fā)生機(jī)理與外邪觸發(fā)體內(nèi)伏痰有關(guān)［10］。歷代治喘名家大都認(rèn)為“伏痰”與哮喘密不可分，可將哮喘的發(fā)病機(jī)理概括為“外因誘發(fā)，觸動(dòng)伏痰，痰隨氣升，氣因痰阻，相互搏結(jié)于氣道”，因此平喘祛痰尤為重要。

咳喘寧口服液是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的自制藥物，是由五虎湯化裁而成的，五虎湯來源于《仁齋直指方》，主治風(fēng)熱壅肺、咳喘痰多者。方中麻黃味辛、微苦，性溫，既可疏風(fēng)解表，又能宣肺平喘，其主要成分麻黃堿有抗炎、緩解支氣管平滑肌痙攣的作用；杏仁味苦，歸肺、大腸經(jīng)，具有止咳平喘、肅降肺氣之功效。兩藥配伍，一宣一降，調(diào)暢氣機(jī)，共為君藥。石膏味辛、甘，性寒，歸肺、胃經(jīng)，清泄肺熱；大青葉味苦，性寒，歸心、胃經(jīng)，功在清熱瀉火，其主要化學(xué)成分葉含靛，具有抑制炎癥反應(yīng)及抗病毒的作用；黃芪味甘，性微溫，歸肺、胃經(jīng)，可補(bǔ)氣健脾，益衛(wèi)固表，增強(qiáng)機(jī)體免疫力；三藥合用，清泄肺熱、健脾益氣，扶正以驅(qū)邪外出，共為臣藥。桃仁味苦、甘，性平，歸心、肝、大腸經(jīng)，活血化瘀，改善炎癥病灶，且可止咳平喘；細(xì)茶葉味苦、甘，性寒，功在醒神化痰；甘草味甘，性平，補(bǔ)氣益中，鎮(zhèn)咳平喘，并可調(diào)和諸藥，共為佐使。諸藥合用，共奏發(fā)表清熱、化痰平喘、活血化瘀功效。

既往實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，咳喘寧口服液可通過降低大鼠肺組織中TLR4及NF-κBP65的表達(dá)來降低氣道炎癥反應(yīng)［11］，李英、譚維等［12-13］通過制作RSV誘導(dǎo)的哮喘大鼠模型，分別使用蒸餾水、醋酸潑尼松片加硫酸沙丁胺醇及咳喘寧口服液治療，發(fā)現(xiàn)咳喘寧可抑制哮喘大鼠嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）浸潤(rùn)，上調(diào)IFN-γ的水平，降低IL-4、IL-17、IL-8及IgE的表達(dá)，從而降低氣道炎癥反應(yīng)，其療效與西藥相當(dāng)。因此可推測(cè)TLR4/NF-κB信號(hào)通路與RSV所誘發(fā)的哮喘關(guān)系密切，咳喘寧口服液可能通過該通路抑制氣道上皮炎癥因子的產(chǎn)生來降低氣道的炎癥反應(yīng)，抑制哮喘的發(fā)生、發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)RSV誘發(fā)的哮喘豚鼠進(jìn)行分組治療，結(jié)果表明咳喘寧可減輕RSV所誘發(fā)的哮喘豚鼠氣道炎癥，降低其肺組織中TLR4、NF-κB mRNA的水平，其療效與西藥相當(dāng)，但作用與藥物劑量相關(guān)。因此，推測(cè)咳喘寧可通過抑制哮喘豚鼠TLR4、NF-κB的表達(dá)，從而減少炎性因子的產(chǎn)生，減輕氣道的炎性反應(yīng)，以達(dá)到緩解癥狀、治療哮喘的作用。