林美芳，鄭 菊，雷 婷，杜 柳，謝紅寧

（中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科，廣東廣州 510058）

圓錐動(dòng)脈干畸形（conotruncal defects，CTD）是一類流出道異常的復(fù)雜型心血管畸形，占先天性心臟?。╟ongenital heart disease，CHD）的20%～30%［1］，通常包括法洛四聯(lián)征、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位、共同動(dòng)脈干、右室雙出口等。先天性心臟病的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，大量的臨床、流行病學(xué)及胚胎學(xué)的研究表明基因異常在先心病的發(fā)生中起到一定的作用［2］。近年來染色體微陣列分析方法（chromosomal micro array CMA）運(yùn)用于心臟病拷貝數(shù)變異檢測(cè)也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)［3-4］。然而，不同的亞型有其特定的基因變化機(jī)制，圓錐動(dòng)脈干畸形作為心臟畸形的一種重要亞型，目前對(duì)其發(fā)生基因機(jī)制了解甚少［5］。為此，本研究運(yùn)用單核苷酸多態(tài)性微陣列方法對(duì)一組相對(duì)大樣本的合并圓錐動(dòng)脈干異常胎兒進(jìn)行拷貝數(shù)變異分析，以闡明其發(fā)生的可能機(jī)制，有助于早期診斷，早期干預(yù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

來自2013年1月至2018年3月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院行產(chǎn)前常規(guī)篩查的孕婦及外院來會(huì)診的病例，其中明確診斷胎兒CTD的孕婦145例納入研究。本研究通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有病例已簽署知情同意書。

1.2 胎兒結(jié)構(gòu)異常的檢查與追蹤

對(duì)懷疑心臟異常胎兒，進(jìn)一步行胎兒超聲心動(dòng)圖檢查，按照國際婦產(chǎn)超聲胎兒超聲心動(dòng)圖指南，由兩位具有10年以上工作經(jīng)驗(yàn)的專家共同初步診斷，同時(shí)識(shí)別心內(nèi)，心外畸形［6］。所使用機(jī)器為Voluson E6/E8。對(duì)所有病例進(jìn)行追蹤，以獲取出生后的超聲心動(dòng)圖、手術(shù)記錄，或尸解結(jié)果進(jìn)一步明確診斷。

1.3 胎兒染色體及基因檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time quantify QFPCR）及單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)用于測(cè)量染色體單體及染色體微重復(fù)及微缺失，其中QFPCR可于48 h出結(jié)果。當(dāng)QF-PCR結(jié)果為常見染色體非整倍體，如21三體、18三體及13三體等時(shí)，則病例被排除，不再進(jìn)一步分析；如果QF-PCR結(jié)果正常，則進(jìn)一步行單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)檢測(cè)。檢測(cè)采用Affymetrix Cytoscan 750 K Array芯片（美國Affymetrix公司產(chǎn)品），該芯片包含750 000個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，分辨率≥100 kb。步驟嚴(yán)格按照操作手冊(cè)進(jìn)行。芯片結(jié)果依據(jù)查詢文獻(xiàn)及根據(jù) DGV（http：//dgv.tcag.ca/dgV/app/home）、Decipher（https：//decipher.sanger.ae.uk/）、在線人類孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）數(shù)據(jù)庫對(duì)檢出的變異進(jìn)行綜合分析，將拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV）分為病理性、臨床意義不明、良性3類。根據(jù)CNV的臨床意義，將病例分為非良性組（病理性CNV+不明意義CNV）和良性組（無CNV+良性CNV）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不服從正態(tài)分布的定量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距描述，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；定性資料采用頻數(shù)和構(gòu)成比描述，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，當(dāng)理論頻數(shù)＜5時(shí)采用Fisher精確概率法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)ɑ=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

研究期間共145例胎兒確診為圓錐動(dòng)脈干異常，其中17例的QF-PCR結(jié)果異常（7例18三體，5例21三體，2例13三體，3例性染色體非整倍體）而被排除。剩余128例QF-PCR結(jié)果正常的胎兒進(jìn)一步分析其超聲特征及拷貝數(shù)變異情況。此128例病例包括法洛四聯(lián)征（n=58）、右室雙出口（n=44）、共同動(dòng)脈干（n=15）、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位（n=11）。孕婦的中位數(shù)年齡30（19～46）歲，中位數(shù)孕齡23（15～31）周。128例病例中，父母選擇終止妊娠81例，胎死宮內(nèi)4例，出生后死亡5例，因此共38例胎兒存活，目前19例已手術(shù)，總體術(shù)后效果良好。

2.2 胎兒結(jié)構(gòu)異常

128例病例中，60例（46.9%）合并心外異常，70例（54.7%）合并心內(nèi)異常。60例合并心外異常的病例包括28例（46.7%）合并單純結(jié)構(gòu)異常，21例（35.0%）合并單純軟指標(biāo)異常，11例（18.3%）胎兒同時(shí)合并結(jié)構(gòu)及軟指標(biāo)異常，常見合并的結(jié)構(gòu)異常為：異構(gòu)綜合征16例（26.7%），骨骼系統(tǒng)異常6例（10.0%），胸腺異常5例（8.3%）；最常合并的軟指標(biāo)異常為：鼻骨缺失12例（20.0%），單臍動(dòng)脈9例（15.0%），枕后皮層增厚6例（10.0%）。在70例合并心內(nèi)異常胎兒中，常見為：持續(xù)性左上腔靜脈（n=22，31.4%），動(dòng)脈導(dǎo)管缺如（n=17，24.3%），房室間隔缺損（n=16，22.9%）。

2.3 胎兒染色體及基因檢測(cè)

128例CTD胎兒中CNV檢出率為14.1%（18/128），其中包括病理性CNV為5.5%（7/128）、臨床意義未明CNV為4.7%（6/128）和良性變異CNV為3.9%（5/128）。因此較之染色體檢查CMA檢查發(fā)現(xiàn)了額外5.5%病理性CNV，包括22q11.21微缺失3例及其他少見病理性CNV 4例。此4例病例其CNV均包含與心臟畸形相關(guān)的基因：1例為右側(cè)異構(gòu)綜合征胎兒（病例No.103），其心臟畸形為右室雙出口，在染色體14q11.2區(qū)域存在1.8 Mb微缺失，此區(qū)域的缺失包含基因PRKD1和NKX2-6；1例法洛四聯(lián)征無合并其他結(jié)構(gòu)畸形的胎兒（病例No.51）在染色體8p23區(qū)域存在219 kb微缺失，此缺失包含MYOM2基因，1例右室雙出口合并耳發(fā)育不良畸形（病例No.88），其染色16p13.3存在微重復(fù)，該區(qū)域包含AXIN1基因，1例右室雙出口病例（病例No.104），在16p11.2存在微缺失，該區(qū)域包含CACNA1C基因。7例病理性CNV和6例不明意義CNV病例的具體基因型及表型情況（表1）。

根據(jù)CNV的臨床意義，將128例病例分為良性CNV組（n=115）及非良性CNV組（n=13），非良性CNV組病例合并心外總異常率（76.9%vs.43.5%，P=0.037），結(jié)構(gòu)性心外異常率（61.5%vs.24.2%，P=0.022）、軟指標(biāo)的異常率（61.5%vs.20.9%，P=0.004）及胸腺異常率（30.8%vs.0.87%，P=0.000）高于良性變異組。兩組間除持續(xù)性左上腔靜脈發(fā)生率（46.2%vs.13.9%，P=0.010）存在差異外，合并心內(nèi)其他異常率無顯著差異，4種圓錐動(dòng)脈干異常的亞型間其非良性變異率無顯著差異（P=0.530）。非良性組的自然死亡率（50%）高于良性組（16.4%），但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2）。

3 討論

CTD是一組影響流出道而解剖結(jié)構(gòu)不同先天性心臟病，最近對(duì)于青少年及成人圓錐動(dòng)脈干異?？截悢?shù)變異的研究偶見報(bào)道［7-9］，而對(duì)于產(chǎn)前的研究較少，本研究是目前為止樣本量較大的研究，我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)病理性CNV檢出率達(dá)5.5%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)合并心外異常提示非良性的拷貝數(shù)變異發(fā)生率較高。因此臨床工作中，需要仔細(xì)識(shí)別所合并的心外異常，將對(duì)判斷是否需要進(jìn)行介入性診斷有重要指導(dǎo)意義。

在所有拷貝數(shù)變異中，合并22q11.2微缺失或微重復(fù)已被多次報(bào)道［10-11］。本組病例中，22q11.2微缺失或微重復(fù)發(fā)生率2.3%（3/128），除2例病例為經(jīng)典的微缺失（病例No.8及病例No.114）外，1例（病例No.86）的微缺失為非典型缺失，此病例為右室雙出口合并單臍動(dòng)脈，缺失27 kb，包含了CLTCL1基因，此基因來源于父親，父親除外一些面部特征如明顯顴骨平坦，沒有明顯的表型。胎兒的父母選擇了引產(chǎn)，胎兒尸解結(jié)果證實(shí)右室雙出口診斷，胸腺缺如，考慮到22q11微缺失的分子機(jī)制的復(fù)雜性［10-13］，我們認(rèn)為此病例存在病理性的拷貝數(shù)變異。

其他非少見的致病性CNV也被報(bào)道與先心病有關(guān)，例如位于1q21.2，11q及9q34區(qū)域的CNV；在我們的研究中，有4例非22q11區(qū)域的致病性CNV被檢出。1例心臟畸形為右室雙出口的右側(cè)異構(gòu)綜合征的胎兒（病例No.103）在染色體14q11.2區(qū)域存在1.8 Mb微缺失，此區(qū)域的缺失包含基因PRKD1和NKX2-6，其中NKX2-6是TBX1信號(hào)通路下游基因，在圓錐動(dòng)脈干分隔形成過程中起到重要作用［14］。而PRKD1基因是有別于TBX1基因另一與圓錐動(dòng)脈干異常有關(guān)的單基因，最近被報(bào)道其作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)基因MEF2，從而在圓錐動(dòng)脈干異常發(fā)生重要作用［15］。另一例法洛四聯(lián)征胎兒（病例No.51）在染色8p23區(qū)域存在219 kb微缺失，此缺失包含MYOM2基因，另外兩例右室雙出口病例，分別在染色體16p13.3存在微重復(fù)，16p11.2存在微缺失，所包含AXIN1，CACNA1C基因均與心臟結(jié)構(gòu)異常有關(guān)［16］。

表1 病理性或臨床意義未明拷貝數(shù)變異的13例胎兒的基因型及表型Table 1 Phenotype and genotype of 13 cases with pathogenic or VOUS CNV

表2 良性組與非良性組臨床特征及結(jié)局比較Table 2 Comparison of prenatal characteristics and outcomes between fetuses with non-benign CNV and those with benign CNV ［n（%）］

本研究結(jié)果表明，圓錐動(dòng)脈干畸形胎兒若合并心外異常提示其合并非良性的CNV可能性大，而所合并心內(nèi)異常發(fā)生率與非良性CNV結(jié)果沒區(qū)別，此結(jié)果與其他成人心臟病的拷貝數(shù)變異的研究結(jié)果相似，Khoshnood［17］指出檢測(cè)心外異常對(duì)先天性心臟病的發(fā)生的原因、機(jī)制、時(shí)間點(diǎn)的研究提供線索，因此在臨床工作中，必須仔細(xì)識(shí)別可能合并的心外異常，將有助于決定該病人是否需要介入性診斷。在先心病的研究中，發(fā)現(xiàn)合并基因的異常胎兒預(yù)后不良［18］。我們的研究也發(fā)現(xiàn)非良性組的自然死亡率比良性組高，但是未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與本組病例引產(chǎn)率高而影響結(jié)局分析有關(guān)。

本研究存在一定的局限性：首先本組病例的引產(chǎn)率較高，影響了胎兒預(yù)后及基因表型的分析；其次并非所有胎兒父母同時(shí)做CMA的檢測(cè)，因此不利于對(duì)臨床意義未明的CNV的解讀。最后，此研究為回顧性分析，存在本身的局限性，期待大樣本的前瞻性的進(jìn)一步闡釋胎兒圓錐動(dòng)脈干畸形的可能基因機(jī)制。

總之，本研究證實(shí)了拷貝數(shù)變異是圓錐動(dòng)脈干畸形的可能發(fā)生機(jī)制之一，我們建議對(duì)合并圓錐動(dòng)脈干畸形胎兒的產(chǎn)前超聲診斷過程中，重視對(duì)包括胸腺異常在內(nèi)的心外異常的仔細(xì)檢查，這將有助于指導(dǎo)臨床是否進(jìn)行介入性診斷。