周 璇, 韓 麗,戴 蕾,平翔蕊,蔣 麗,何霞紅,杜云龍

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201； 2.云南生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201；3 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物多樣性與病害控制教育部重點實驗室， 云南 昆明 650201)

三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H. Chen是五加科人參屬植物，在我國屬于傳統(tǒng)名貴中藥材。三七含有的三七皂苷等有效成分具有散瘀止血、消腫定痛的功效。據(jù)記載，三七在我國已有600 a以上的藥用歷史，馴化栽培歷史已逾400 a[1～2]。但是，三七的人工種植受到環(huán)境條件、病害(立枯病、根腐病、圓斑病和疫病)、蟲害(蚜蟲、紅蜘蛛和介殼蟲)[3]和連作障礙的嚴(yán)重影響[4]。因此，上述因素造成了三七的種植條件要求較高、生產(chǎn)難度大、產(chǎn)量低。我們將通過化學(xué)誘變的方法篩選具有適應(yīng)不同環(huán)境條件如低溫的三七植株,為三七育種提供種質(zhì)資源?；瘜W(xué)誘變是篩選植物突變體的常用方法。化學(xué)誘變劑可分為烷化劑、堿基類似物和嵌入染料三大類[5]，常見的化學(xué)誘變劑有甲基磺酸乙酯(EMS)、疊氮化鈉(NaN3)和平陽霉素(PYM)。EMS因其低成本，易操作，專一性高而成為應(yīng)用普遍的誘變方法，無論是種子、愈傷組織、花粉及小孢子等均可作為誘變對象[6]。目前EMS作為常用和有效的化學(xué)誘變劑，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水稻、小麥、玉米、大豆[6]、油菜[7]、甜橙[8]及草莓[9]的育種。EMS烷化作用誘發(fā)的點突變或染色體缺失均能穩(wěn)定地遺傳給子代[10]，并且產(chǎn)生的突變體大多為顯性突變體，方便田間觀察[11]。EMS誘變突變植株的染色體畸變情況少，突變率高，在小麥中的突變概率為1/41.55 kb[12]，擬南芥為1/170 kb[13]。因此，利用EMS誘變方法，經(jīng)過選育可以獲得所需的植株表型。三七目前沒有人工選育的品種，并且暫無研究者利用EMS等化學(xué)誘變的方法選育三七品種。在該項研究中，我們將選用不同濃度的EMS誘變?nèi)叻N子，從而篩選一批表型發(fā)生明顯變化以及具有抗衰老特征的三七突變體植株，為三七產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供種質(zhì)資源；同時，也為使用EMS誘變技術(shù)開展中藥材育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與試劑

三七種子來源于云南文山三七市場。所用到的主要試劑有0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0)，0.06 mol·L-1PBS，0.3%、0.4%、0.5% 的EMS溶液。EMS溶液用1.2 mg·mL-1的EMS母液配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 EMS 誘變?nèi)邔嶒灧椒?將成熟的三七種子清洗干凈，分別用0.06 mol·L-1PBS，0.3%、0.4%、0.5%的EMS誘變劑浸泡15 h。用5%硫代硫酸鈉溶液對誘變?nèi)叻N子的EMS溶液進(jìn)行中和反應(yīng)10 min 后，三七種子在流水下沖洗2 h，對種子進(jìn)行子沙埋培養(yǎng)，待三七種子發(fā)芽后，將其種植在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)在 “三七現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究和中試基地”。

1.2.2 抗衰老植株篩選 將EMS誘變處理后的三七種子種植三七大棚中，并同時種植經(jīng)0.06 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)處理的種子作為對照。經(jīng)過4 a種植后，根據(jù)植株地上部分的枯萎狀態(tài)篩選具有抗衰老特征的三七。

1.2.3 測定植物內(nèi)源激素 對四年生的具有抗衰老特征的誘變?nèi)叩娜~片進(jìn)行取材，對照為同一時期種下的未經(jīng)EMS誘變的野生型三七植株葉片。三七葉片稱取量不低于200 mg，使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-MS/MS)測定內(nèi)源激素的種類及含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS誘變?nèi)叻N子的萌發(fā)率

采用0.3%、0.4%、0.5%三個濃度的EMS溶液處理三七種子，與PBS處理的對照組同時種在大棚內(nèi)。0.3%EMS誘變的三七播種1 186顆，出苗449顆,出苗率37.9%；0.4%EMS誘變的三七播種1 180顆，出苗470顆，出苗率39.8%；0.5%EMS誘變的三七播種1 182顆，出苗438顆，出苗率37.1%，而對照組的出苗率為43%(圖1)。因此，EMS溶液對三七種子的發(fā)育具有一定的抑制作用。

圖1 EMS處理降低三七種子出苗率

2.2 EMS處理可影響三七植株表型

經(jīng)EMS誘變處理后三七小苗種植于三七大棚內(nèi)，生長2 a后，有些植株的表型發(fā)生變異，主要表現(xiàn)為：葉片明顯變小變窄(圖2B)、花型變小(圖2C)、植株葉片發(fā)育不完全(圖2D)。但是，發(fā)生上述表型變化的三七植株數(shù)量少，在生長過程中的存活率相比野生型低，這暗示上述突變對三七的生長是有害突變。

注：A：野生型植株， B：葉片變小變窄植株， C：花型變小植株， D：葉片發(fā)育不完全植株

2.3 EMS處理可獲得抗衰老三七植株

EMS誘變后的三七植株種植4 a后，發(fā)現(xiàn)在冬季到來前，部分誘變?nèi)吲c對照三七生長狀態(tài)出現(xiàn)明顯不同。在2017年11月3日觀察時發(fā)現(xiàn)有3株EMS誘變?nèi)叩牡厣喜糠稚L狀態(tài)良好，種皮綠色或微紅，未出現(xiàn)衰老現(xiàn)象(圖3B)，而同期對照三七的葉片已經(jīng)枯萎(圖3A)。1個月后的跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)對照三七地上部分幾乎全部枯萎，莖桿倒伏(圖3C)，但3株EMS誘變?nèi)咧械?株(EMS1)的葉片仍為綠色，種皮微紅，另2株(EMS2,EMS3)的種皮紅色，葉片開始變黃(圖3D)。對照三七與EMS誘變?nèi)呱L于同一塊大田中，其光照、溫度、水分等環(huán)境條件均相同，但其抗衰老能力明顯不同。因此，EMS誘變可以篩選到具有抗衰老能力的三七植株，從而增加三七對非生物脅迫的抗性。

注：A, B：植株觀察于2017年11月3日；C, D：植株觀察于2017年12月3日; CK是未經(jīng)誘變的對照植株

圖4 三七突變體內(nèi)源激素含量

為了進(jìn)一步分析EMS誘變?nèi)叩目顾ダ蠙C(jī)制，2017年11月3日我們對3株抗衰老三七(即EMS1/EMS2/EMS3)和同一塊大田的對照三七進(jìn)行葉片采樣，檢測葉片中植物激素水楊酸(SA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、茉莉酸-異亮氨酸(JA-Ile)的含量。在3株EMS誘變?nèi)咧?，IAA的含量均明顯升高(圖4B)，但ABA的含量在EMS2株系中顯著增加，而在EMS1株系中降低，在EMS3株系中與對照植株相比沒明顯變化(圖4A)。對JA的含量測量后，發(fā)現(xiàn)EMS1和EMS2株系的茉莉酸含量明顯升高，EMS3的含量沒有發(fā)生明顯變化(圖4C)。而在JA-Ile的測量中，發(fā)現(xiàn)EMS1和EMS2株系的JA-Ile含量明顯升高，EMS3株系的含量明顯降低(圖4D)。對SA含量進(jìn)行測量后，發(fā)現(xiàn)EMS1株系中的水楊酸含量明顯升高，而EMS2和EMS3株系中的水楊酸含量與對照植株相比沒有明顯的差別(圖4E)。

3 討論

三七是我國傳統(tǒng)名貴中藥，但長期以來，三七由于沒有人工選育品種，導(dǎo)致三七在生產(chǎn)中面臨許多問題[14]。在該項研究中，我們發(fā)現(xiàn)部分經(jīng)EMS誘變的三七的花及葉的表型發(fā)生了明顯的變異，部分EMS誘變的三七植株表現(xiàn)出抗衰老的能力。這顯示利用EMS誘變技術(shù)，可以使三七產(chǎn)生豐富的遺傳多樣性，有利于選育性狀優(yōu)良的三七品種。利用EMS誘變的方法，在選育具有目標(biāo)性狀的植株上有著明顯的作用。目前，在包括馬鈴薯、豇豆、金葵花等食用作物上都獲得了性狀優(yōu)異的植株[15]。例如，甘藍(lán)型油菜經(jīng)EMS誘變的后代在子葉、葉片、花器、株型、角果和種皮這6個器官均發(fā)生了不同頻率的突變[6]。在該項研究中，我們發(fā)現(xiàn)三七對EMS濃度具有依賴性(圖1)。在獲得的EMS突變體中，發(fā)現(xiàn)少量突變體的花及葉表型發(fā)生了有害突變(圖2)，并且EMS誘變后三七出苗率降低，我們猜測EMS誘變對三七具有一定的致死效應(yīng)。

植物激素對植物的生長發(fā)育起到非常重要的作用。在植物激素中，IAA可調(diào)控植物的生長發(fā)育[16]，脫落酸[17]、水楊酸與茉莉酸同植物的衰老密切相關(guān)[18～21]。當(dāng)植物處于不良環(huán)境脅迫時，水楊酸會迅速在植物體內(nèi)積累，減少不良環(huán)境對植物的影響[18]。在植物衰老過程中，水楊酸可以延緩蛋白質(zhì)降解，達(dá)到減緩植物衰老的作用[19]。當(dāng)植物受到水分、干旱、病原菌和昆蟲脅迫時，體內(nèi)的茉莉酸含量顯著增加，以維持生長[20]。此外，茉莉酸和ERF轉(zhuǎn)錄因子也參與調(diào)控植物葉片衰老[21]。在我們所篩選的抗衰老三七突變體中，發(fā)現(xiàn)三七突變體EMS1, EMS2及EMS3植株的生長素含量都明顯高于野生型(圖4B)，這與植株的地上部分的生長狀態(tài)相符合。但我們同時發(fā)現(xiàn)具有抗衰老能力的EMS1植株的ABA含量明顯降低 (圖4A)，同時伴隨有水楊酸(圖4E)、茉莉酸(圖4C)和茉莉酸-異亮氨酸(圖4D)含量的明顯增加。這暗示在三七生長中，增加脫落酸的含量會促進(jìn)三七的衰老。水楊酸在植物遭受干旱、寒冷、病原物入侵時會大量產(chǎn)生[22]，以保證植株健康生長[23]。EMS1株系中水楊酸含量最高，并且在三個抗衰老突變體EMS1， EMS2及EMS3植株中，地面部分最晚衰老(圖3D)，水楊酸含量的升高可能有助于三七延緩衰老，這可能與水楊酸提高三七對低溫的抵抗能力有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸會通過抑制光合作用等機(jī)制促進(jìn)植物衰老[24～25]。在EMS1突變體三七中，我們發(fā)現(xiàn)JA及JA-Ile的含量升高(圖4C，D)，這暗示了水楊酸與ABA，JA及JA-Ile的相互作用對調(diào)控三七衰老過程起到重要作用，但是相關(guān)的機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。對抗衰老三七植株中的內(nèi)源激素含量分析，有助于揭示三七在非生物脅迫條件如低溫、干旱下生長的機(jī)制，從而有利于合理使用植物激素，促進(jìn)三七產(chǎn)業(yè)的健康生長。

4 結(jié)論

通過EMS誘變的方法，我們獲得一些表型發(fā)生變化的三七植株,包括葉片畸形，葉片發(fā)育不完全、花型小等。同時，初步篩選到具有抗衰老能力的三七突變體植株，其中水楊酸、生長素、脫落酸、茉莉酸和茉莉酸-異亮氨酸的相互作用對三七的正常生長起到非常重要的作用。