張 瑜，溫 娟，聶 剛，李向云，唐慧菁

（1.中山大學附屬第七醫(yī)院皮膚科，廣東 深圳 518000；2.中山大學附屬第五醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 珠海 519000）

腎缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷是糖尿病患者進行大中型手術術后較易出現(xiàn)的嚴重并發(fā)癥，引起大范圍腎小管上皮細胞壞死，腎功能嚴重受損，甚至引起腎功能衰竭并危及生命。糖尿病作為威脅人類健康常見病之一，全球患者將近5億人，而我國有將近1億糖尿病患者并逐年遞增。且腎由于其含有豐富血管網(wǎng)絡，較易出現(xiàn)I/R損傷，尤其是糖尿病患者易出現(xiàn)腎小血管病變，更易出現(xiàn)腎I/R損傷甚至急性腎衰［1-3］。由于糖尿病患者腎I/R損傷發(fā)病率極高，可引起嚴重并發(fā)癥和極高死亡率［4-5］。研究表明，選擇恰當麻醉藥物對I/R損傷能起到有效預防作用。因此，探討糖尿病腎I/R損傷發(fā)病機制及探索選擇恰當?shù)穆樽硭幬飳︻A防糖尿病腎I/R損傷具有重要臨床意義。

許多研究表明，炎癥反應和細胞凋亡在腎I/R損傷中起著關鍵作用［6-8］。腎I/R損傷可引起炎癥和凋亡信號通路的活化，而炎癥和凋亡兩者之間可能相互作用，從而使I/R損傷擴大化［9-12］。既往研究發(fā)現(xiàn)，異氟烷（isoflurane，Iso）麻醉預處理可對重要臟器（如大腦、心、肝和腎等）I/R損傷有重要的保護作用［13-19］。目前，糖尿病腎I/R損傷發(fā)病機制尚不完全明確，關于Iso與糖尿病腎I/R損傷保護的相關研究較少。因此，本課題組通過制備腎I/R模型，進一步探討糖尿病腎I/R損傷發(fā)病機制及Iso在糖尿病模型大鼠I/R腎損傷中的影響及作用機制，為糖尿病患者進行大中型全麻手術如何選擇恰當?shù)穆樽硭幬锾峁┮欢ǖ膶嶒炓罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

鏈佐星（streptozotocin，STZ）購自美國Sigma-Aldrich公司；Iso購自美國Baxter公司；兔抗大鼠核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）多克隆抗體購自德國Merck Millopore公司；山羊抗大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）多克隆抗體購自美國R&D公司；免疫組化試劑盒購自美國R&D公司；PBS緩沖液購自中國福州邁新公司；Tris-EDTA修復液購自廣州安必平公司。3.7 cm無創(chuàng)動脈夾購自中國上海金鐘手術器械廠；動物麻醉儀器購自中國上海海瑞曼信息技術有限公司；Datex Ultima麻醉監(jiān)測儀購自芬蘭Datex有限公司；全自動生化測定儀購自日本HITACHI日立集團有限公司；血糖儀購自德國拜耳公司；顯微鏡購自日本Olympus公司；NIS元素成像軟件4.10版購自日本東京尼康公司。

1.2 大鼠糖尿病腎l/R損傷模型制備和分組給藥

清潔級雄性健康SD大鼠，體質量為180～200 g，購自中山大學實驗動物中心并獲得了倫理審批（SCXK（粵）2011-0029，飼養(yǎng)條件：在動物房通風、清潔環(huán)境下飼養(yǎng)，溫度控制在18～26℃，相對濕度40～70%）。在清潔、通風環(huán)境下飼養(yǎng)2周。實驗前禁食12 h，注射STZ 60 mg·kg-1制備糖尿病大鼠模型，72 h后大鼠尾靜脈采血，用血糖儀測定血糖，空腹血糖＞16.7 mol·L-1認為造模成功［20］。將糖尿病模型大鼠隨機分為3組，每組8只：假手術組，腎I/R損傷組和2%Iso預處理30 min+I/R組。

制備腎I/R損傷模型［21］前復測大鼠體質量和血糖。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（400 mg·kg-1）麻醉大鼠，并進行腹中線剖腹手術。將雙側腎蒂充分暴露后并使用非創(chuàng)傷性血管夾閉腎蒂45 min，當腎顏色由鮮紅色變蒼白色時，誘導缺血成功。45 min后移除非創(chuàng)傷性血管夾，當腎顏色從紫紅色變?yōu)轷r紅色時，視為成功恢復腎血流再灌注。逐層縫合手術切口后，大鼠自由進食和飲水。24 h后，麻醉狀態(tài)下處死大鼠，采集血液和腎樣本進行進一步分析。

Iso預處理組［22］，先將密封麻醉的玻璃箱一端連接動物麻醉儀器，而另一端2個孔分別連接排氣孔和Datex Ultima麻醉氣體監(jiān)測儀。玻璃箱底鋪鈉石灰并箱內(nèi)燈泡加熱以保證溫度維持為35～37℃。將Iso氣流設定為1 L·min-1。當Iso濃度穩(wěn)定在2%時，將大鼠置箱中30 min。然后將大鼠中取出，置正常空氣中洗脫10 min后再進行腎I/R損傷模型制作。

假手術組和腎I/R損傷組大鼠接受相同的手術方案，但假手術組僅分離但不夾閉腎蒂。

給藥及檢測時間點總結如下：①注射STZ 60 mg·kg-1制備糖尿病大鼠模型：實驗前，大鼠禁食12 h；②72 h后：尾靜脈采血測定血糖，空腹血糖≥16.7 mol·L-1認為糖尿病大鼠模型造模成功，然后進行腎I/R損傷模型制備，Iso組大鼠先用2%Iso預處理30 min，然后再進行手術。③腎I/R損傷模型制備后24 h，采集血液和腎組織標本，自動生化分析儀測定尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和肌酐（creatinine，Cr），HE染色檢測腎病理和TUNEL染色檢測腎小管上皮細胞凋亡，免疫組化檢測TNF-α和NF-κB的表達。

1.3 采集血液和腎組織標本

從大鼠下腔靜脈采集約5 mL血液，并將其加入抗凝管。將血樣在室溫下儲存30 min，然后在3℃冰箱冷存過夜。使用自動生化分析儀測定BUN和Cr。采血后切除雙側腎。其中一份保存在10%甲醛溶液中，用于組織病理學檢查。另一份在液氮中快速冷凍，并在-80℃下保存以供進一步分析。

1.4 HE染色檢測腎組織病理變化

腎組織在95%乙醇中脫水，石蠟包埋并切片，用蘇木精-伊紅（HE）染色。每個樣本隨機選取10張腎組織照片（20倍物鏡下拍攝），使用NIS元素成像軟件4.10版評估腎小管損傷程度。腎小管損傷的嚴重程度按以下標準進行組織學分級（0～4分）［23］：0分，近曲小管細胞未見明顯壞死；1分，單個近曲小管細胞壞死；2分，壞死涉及所有相鄰近曲小管細胞；3分，遠端近曲小管壞死，伴有腎皮質壞死；4分，所有腎小管壞死。

1.5 TUNEL染色檢測腎小管上皮細胞凋亡

常規(guī)切片脫蠟并修復，滴加過氧化物酶滅活內(nèi)源性酶，滴加TUNEL檢測液，最后DAB顯色，蘇木精復染色。正常細胞顏色為藍色，而腎小管上皮細胞TUNEL陽性凋亡細胞為棕褐色。每個樣本隨機選取5張腎組織照片（20倍物鏡下拍攝），通過以下公式計算得出腎小管上皮細胞凋亡率：細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.6 免疫組化法檢測TNF- α和NF-кB的表達

腎組織用石蠟包埋后切片，常規(guī)脫蠟，用Tris-EDTA抗原修復液促進抗原修復，用3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，分別滴加抗NF-кB抗體稀釋液（1∶100）和抗TNF-α抗體稀釋液（1∶50），在4℃培養(yǎng)過夜。PBS緩沖液洗滌后滴加R&D免疫組化試劑盒二抗，37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1 h，PBS洗滌干凈后滴加DAB溶液顯色5～10 min，顯微鏡下掌握染色程度，自來水沖洗終止顯色。蘇木素復染1 min，待切片晾干后中性樹脂封片。

采用免疫組化染色定量分析：每個樣本隨機選取10張腎組織照片（20倍物鏡下拍攝），采用NISElements圖片分析軟件Version 4.10進行統(tǒng)計分析，以棕色區(qū)域面積與平均吸光度值兩者之間乘積表示TNF-α和NF-кB的表達水平。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 lso對腎l/R損傷糖尿病模型大鼠體質量、血糖和腎功能指標的影響

3組大鼠體質量無顯著性差異（表1）。糖尿病模型大鼠腎I/R組和Iso預處理組大鼠血糖高于假手術組（P＜0.05），但糖尿病大鼠腎I/R組、Iso預處理組之間血糖無統(tǒng)計學差異。與假手術組相比，腎I/R組的BUN和Cr水平明顯升高（P＜0.01），說明糖尿病模型大鼠腎I/R模型制備成功。經(jīng)過Iso預處理后，Iso預處理組的BUN和Cr水平較腎I/R組明顯下降（P＜0.01），提示Iso對糖尿病模型大鼠腎I/R損傷有保護作用。

2.2 lso對腎l/R損傷糖尿病模型大鼠腎組織病理變化的影響

與糖尿病模型大鼠假手術組比較，I/R組腎小管壞死程度明顯（P＜0.01）（圖1）；而Iso預處理組腎小管壞死程度明顯低于腎I/R組（P＜0.01）。提示糖尿病模型大鼠腎I/R損傷可引起腎小管上皮細胞明顯壞死，而經(jīng)過Iso預處理能明顯抑制糖尿病模型大鼠腎I/R損傷引起腎小管壞死。

2.3 lso對腎l/R損傷糖尿病模型大鼠腎小管上皮細胞凋亡的影響

糖尿病模型大鼠腎I/R組TUNEL陽性凋亡細胞明顯高于假手術組（P＜0.01）（圖2）；Iso預處理組TUNEL陽性細胞數(shù)低于腎I/R組（P＜0.01）。提示在糖尿病模型大鼠腎I/R損傷組中，TUNEL陽性細胞率明顯升高；然而，Iso預處理顯著降低糖尿病模型大鼠I/R腎小管上皮的凋亡。

Fig.1 Effect of isoflurane on renal histopathological changes in diabetic rats with renal l/R injury.See Tab.1 for the rat treatment.Different degrees of tubular dilation and necrosis were indicated by the black arrows.±s，n=8.＊＊P＜0.01，compared with sham group；##P＜0.01，compared with renal I/R injury group.

Tab.1 Effects of isoflurane（lso）on physical，biochemical parameters and renal function in diabetic model rats with renal ischemia-reperfusion（l/R）injury

Fig.2 Effect of isoflurane on apoptosis of renal tubular epithelial cells in diabetic rats with renal l/R injury.See Tab.1 for the rat treatment.±s，n=8.＊＊P＜0.01，compared with sham group；##P＜0.01，compared with I/R injury group.Apoptotic renal tubular epithelial cells were indicated by black arrows.

2.4 lso對腎l/R損傷糖尿病模型大鼠腎組織TNF- α和NF- κB表達水平的影響

TNF-α主要表達于腎小管上皮細胞的細胞質，而NF-κB陽性表達于細胞核和細胞質（圖3）。與假手術組比較，糖尿病模型大鼠I/R組腎組織TNF-α和NF-кB表達明顯升高（P＜0.01）；Iso預處理組TNF-α和NF-кB的表達明顯低于I/R組（P＜0.01）。表明糖尿病模型大鼠腎I/R損傷與TNF-α和NF-кB表達水平升高有關，Iso預處理能明顯抑制TNF-α和NF-кB的表達。提示Iso對糖尿病模型大鼠腎I/R損傷的保護作用機制，可能是通過抑制TNF-α和NF-кB的表達而發(fā)揮保護作用。

Fig.3 Effect of isoflurane on expressions of tumor necrosis- α（TNF- α）（A1，A2）and NF-кB（B1，B2）in renal tissue of diabetic rats with renal l/R injury.See Tab.1 for the rat treatment.±s，n=8，＊＊P＜0.01，compared with sham group；##P＜0.01，compared with renal I/R injury group.TNF-α positive staining was expressed in tubular epithelial cell cytoplasm，and NF-кB positive staining was expressed in tubular epithelial cell nucleus and cytoplasm，as indicated by black arrows.

3 討論

本研究結果表明，I/R可引起糖尿病模型大鼠腎損傷，而經(jīng)過Iso預處理后對腎有保護作用，可降低BUN和Cr的水平，并抑制腎小管上皮細胞壞死和凋亡。糖尿病模型大鼠腎I/R損傷引起TNF-α和NF-кB表達水平明顯升高，提示糖尿病模型大鼠腎I/R損傷與TNF-α和NF-кB表達升高有關；Iso預處理能明顯抑制TNF-α和NF-кB的表達，提示Iso對糖尿病模型大鼠腎I/R損傷的保護作用機制可能是通過抑制TNF-α和NF-кB的表達而發(fā)揮保護作用。

值得注意的是，目前國內(nèi)外關于糖尿病大鼠腎I/R損傷相關研究較少。既往研究表明，I/R損傷機制涉及多種因素，機制尚未完全明確，可能與大量氧自由基的產(chǎn)生、細胞內(nèi)鈣超載、線粒體凋亡、炎癥因子的調(diào)控等有密切關系［24-25］，I/R損傷產(chǎn)生的各種炎癥介質可能與細胞凋亡相互作用，從而使凋亡信號轉導通路逐漸放大，也使得缺血低氧性腎損傷的發(fā)生機制更為復雜。其中炎癥反應和細胞凋亡是I/R損傷的重要機制［6-8］。既往有研究發(fā)現(xiàn)，腎I/R損傷與炎癥因子有明確關系［26］，NF-кB和TNF-α兩者在炎癥因子中起到關鍵主導作用［27］。研究結果表明，糖尿病模型大鼠腎I/R損傷引起腎小管上皮細胞凋亡增加、TNF-α和NF-кB表達水平明顯升高，提示糖尿病模型大鼠腎I/R損傷發(fā)病機制與腎小管上皮細胞凋亡增加及TNF-α和NF-кB表達升高有關，研究結果與研究報道一致。

腎I/R損傷是糖尿病患者進行大中型手術較易出現(xiàn)的嚴重并發(fā)癥之一，研究表明，選擇恰當麻醉藥物對I/R損傷能起到有效預防作用。Iso是一種吸入性全身麻醉藥，目前在全身麻醉誘導和維持中得到廣泛應用。通過Iso預處理，能保護腎或非腎器官免受I/R的損傷。既往研究表明，Iso預處理能抑制家兔心肌I/R損傷TNF-α和胱天蛋白酶3蛋白的表達，從而對家兔心肌I/R損傷起到保護心肌作用［28］。Iso對腸道I/R損傷有保護作用，機制主要是通過活化PPARγ進一步抑制TNF-α等炎癥因子的表達而起到保護作用［29］。應用Iso麻醉對大鼠肝I/R損傷TNF-α相關系列炎癥細胞因子和氧化應激有抑制作用，進而保護肝免受I/R的損傷［30］。另有研究發(fā)現(xiàn)，Iso預處理通過抑制IL-1，TNF-α和NF-кB等因子表達，進而通過抗炎癥和抗凋亡作用改善大鼠腎I/R注損傷［31-32］。

本研究發(fā)現(xiàn)，Iso預處理可顯著抑制BUN和Cr水平和腎小管上皮細胞壞死和凋亡，表明Iso預處理對糖尿病模型大鼠腎I/R損傷起到重要保護作用。糖尿病模型大鼠腎I/R損傷引起TNF-α和NF-кB表達水平升高，而經(jīng)過Iso預處理能明顯抑制TNF-α和NF-кB的表達，提示糖尿病模型大鼠腎I/R損傷發(fā)病機制與TNF-α和NF-кB表達升高有關，而Iso對糖尿病模型大鼠腎I/R損傷的保護作用機制，可能是通過抑制TNF-α和NF-кB的表達而起到保護作用。

綜上所述，Iso對糖尿病模型大鼠I/R腎損傷具有保護作用，可顯著降低BUN和Cr水平，并明顯減少腎小管上皮細胞壞死與凋亡。糖尿病模型大鼠腎I/R損傷發(fā)病機制與TNF-α和NF-кB表達升高有關，Iso對糖尿病模型大鼠腎I/R損傷的保護作用機制，可能是其通過抑制TNF-α和NF-кB的表達而起到保護作用。糖尿病患者進行大中型手術可引起腎等器官發(fā)生I/R損傷，因此選擇Iso作為麻醉藥物，對預防腎等器官發(fā)生I/R損傷具有重要臨床意義。