霍光明，張李陽，朱枳穆，俞麗娜

(1.南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，江蘇南京211171； 2.江蘇省高校“特殊生物質(zhì)廢棄物資源化利用”重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京211171)

纖維素酶在許多工業(yè)應(yīng)用過程中都起著重要作用，已被用在食品加工、紙張回收、清潔生產(chǎn)和動(dòng)物飼料添加劑等領(lǐng)域[1-2]。將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為大宗化學(xué)品是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的中心工作[3]。因此，尋找轉(zhuǎn)化效率高、穩(wěn)定性好、適應(yīng)能力強(qiáng)且價(jià)格便宜的產(chǎn)纖維素酶菌株是研究熱點(diǎn)之一。

放線菌是一類具有降解纖維素能力的重要微生物，具有將纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的能力，可用于生產(chǎn)大宗化學(xué)品,受到研究者關(guān)注[4-5]。鏈霉菌是放線菌中數(shù)量最大、研究最多的一類菌。鏈霉菌屬中的許多種菌具有分解纖維素的能力，但一般分解纖維素能力較弱，且多為高溫放線菌；雖然有中溫放線菌對(duì)纖維素分解的報(bào)道，但大多仍屬形態(tài)學(xué)、生態(tài)學(xué)方面的觀察[1]。

本研究報(bào)道了1株來源于南京方山鞭蝎Typopeltiscrucifer腸道的鏈霉菌Streptomycessp.S10A09，具有較強(qiáng)的分解纖維素的能力，采用軟件Minitab 15中的Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì)法、CCD中心組合設(shè)計(jì)法和響應(yīng)面分析方法(RSM)對(duì)Streptomycessp.S10A09進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，以期為纖維素酶的生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種來源

從Typopeltiscrucifer腸道中分離獲得的能降解纖維素的菌株Streptomycessp.S10A09，保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保存編號(hào)為CCTCC M 2014462。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子液培養(yǎng)基(羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養(yǎng)基)(g/L)：CMC-Na 10、NH4NO31.0、酵母膏1.0、MgSO4·7H2O 0.5、KH2PO41.0。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)： CMC-Na 10、(NH4)2SO44、KH2PO42、MgSO40.3、FeSO4·7H2O 0.01、NaCl 0.2、ZnSO40.002、MnCl20.002、CoCl20.002。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株液體發(fā)酵

將初篩到的菌株活化后接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下培養(yǎng)4 d。種子液以體積分?jǐn)?shù)10%接種量轉(zhuǎn)接于裝有100 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的體積250 mL三角瓶中，于28 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)4 d。

1.2.2 粗酶液的制備

將發(fā)酵培養(yǎng)液于4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定酶活。

1.2.3 纖維素酶活力的測(cè)定(DNS法)

1)總酶活(濾紙酶活力(FPA))測(cè)定。參照文獻(xiàn)[7]并稍作修改。取稀釋10倍后的粗酶液0.5 mL，加入1.0 mL 0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液(pH 4.8)和50 mg新華濾紙，以不加底物為對(duì)照，50 ℃反應(yīng)60 min，加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液，沸水浴5 min，再將試管置于冷水浴中，待試管冷卻后，加入18 mL蒸餾水。以空白管做對(duì)照，采用分光光度計(jì)測(cè)540 nm處的OD540值。

2)纖維素內(nèi)切酶(羧甲基纖維素酶)活力測(cè)定。參照文獻(xiàn)[8]并稍作修改。取稀釋10倍后的粗酶液0.5 mL，加入1.0 mL、pH 4.8的1%CMC-Na溶液，對(duì)照管中不加底物，50 ℃反應(yīng)30 min，加入3 mL DNS溶液，沸水浴5 min，再將試管置于冷水浴中，待試管冷卻后，加入18 mL蒸餾水。以空白管做對(duì)照，采用分光光度計(jì)測(cè)540 nm處的OD540值。

3)纖維素外切酶(微晶纖維素酶)活力測(cè)定。參照文獻(xiàn)[9-11]并稍作修改。取0.5 mL稀釋3倍后的酶液，加入1.0 mL、1%的微晶纖維素溶液(pH 4.8)，以不加底物為對(duì)照，50 ℃反應(yīng)60 min，加入3 mL DNS溶液，沸水浴5 min，再將試管置于冷水浴中，待試管冷卻后，加入18 mL蒸餾水。以空白管做對(duì)照，采用分光光度計(jì)測(cè)540 nm處的OD540值。

4)β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定。參照文獻(xiàn)[12]并稍作修改。取0.5 mL稀釋3倍后的酶液，加入1.0 mL、1%的水楊苷溶液(pH 4.8)，以不加底物為對(duì)照，50 ℃反應(yīng)30 min，加入3 mL DNS溶液，沸水浴5 min，再將試管置于冷水浴中，待試管冷卻后，加入18 mL蒸餾水。以空白管做對(duì)照，采用分光光度計(jì)測(cè)540 nm處的OD540值。

5)FPA酶活力計(jì)算方法。酶活力定義：在pH 4.8、50 ℃條件下，每1 mL酶液在1 min內(nèi)水解底物生成1 μg葡萄糖的酶量稱作一個(gè)酶活力單位(U)。

纖維素酶活力=1 000Gn/(0.5t)

(1)

式中：G為所測(cè)得的OD540值在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的還原糖質(zhì)量濃度(mg/mL)，n為酶液的稀釋倍數(shù)，1 000為毫克換算成微克，0.5為反應(yīng)酶液的體積(mL)，t為酶和底物反應(yīng)時(shí)間(min)。

1.2.4 菌株產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

1)碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定產(chǎn)纖維素酶的最佳碳源。分別以CMC-Na 10 g、葡萄糖5 g、玉米漿10 g、蔗糖5 g、甘油5 g、甲殼素5 g以及黃芪藥渣粉10 g為碳源。生長好的種子液按照體積分?jǐn)?shù)10%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)5 d。發(fā)酵液在5 500 r/min下離心10 min，上清液即為粗酶液，測(cè)定其FPA。通過FPA確定最佳碳源。

2)氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響。在確定最佳碳源的基礎(chǔ)上，用不同的氮源代替發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的(NH4)2SO4，選擇的氮源有(NH4)2SO4、麩皮、蛋白胨、酵母膏和黃豆粉共5種氮源，將種子液以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5 d。發(fā)酵液5 500 r/min離心10 min，得到的上清液即為粗酶液。通過測(cè)定FPA確定最佳氮源。

3)金屬離子對(duì)放線菌產(chǎn)酶活性的影響。在碳氮源相同的情況下，選擇7種金屬離子進(jìn)行篩選，研究對(duì)纖維素酶活力有影響的金屬離子，見表1。

4)Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和CCD中心組合設(shè)計(jì)。利用Minitab 15軟件[13]，實(shí)驗(yàn)中選用N=12的 PB 設(shè)計(jì)，把每個(gè)因素設(shè)計(jì)成高(+1) 和低(-1) 2 個(gè)水平。然后根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)篩選出的對(duì)纖維素酶活具有顯著影響的因素，采用CCD中心組合設(shè)計(jì)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，建立回歸方程并進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表1 對(duì)纖維素酶活力影響的7種金屬離子

注：“+”表示含有該培養(yǎng)基成分；“—”表示未添加該培養(yǎng)基成分。

5)驗(yàn)證試驗(yàn)。根據(jù)PB和CCD實(shí)驗(yàn)建立的模型的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定FPA作為驗(yàn)證指標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

纖維素酶是一種誘導(dǎo)酶，因此纖維素既可以作為碳源來源，又可以作為主要誘導(dǎo)物。通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選了7種不同的碳源進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果見表2。

由表2可知，CMC-Na和葡萄糖作為碳源，產(chǎn)生的總酶活(FPA)最高可達(dá)43 U/mL以上。由于CMC-Na價(jià)格低于葡萄糖，且產(chǎn)生生物量大，綜合考慮選擇CMC-Na為碳源。

表2 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.2 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選5種類型的氮源進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如表3所示。

由表3可以發(fā)現(xiàn)，以(NH4)2SO4組成的無機(jī)氮源發(fā)酵后產(chǎn)生的總酶活FPA最高，明顯高于有機(jī)氮源的培養(yǎng)基。故選擇(NH4)2SO4作為氮源。

2.3 金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響

通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選不同類型的金屬離子進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定不同金屬離子對(duì)產(chǎn)纖維素酶活力的影響，結(jié)果見表4。

由表4可知，Zn2+和Ca2+對(duì)產(chǎn)纖維素酶有抑制作用[16]，而K+和Fe3+缺少會(huì)降低酶活。

2.4 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選重要因素

運(yùn)用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，快速篩選出培養(yǎng)基不同類型成分中對(duì)放線菌Streptomycessp.S10A09 產(chǎn)纖維素酶影響的顯著因素，PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果和主效應(yīng)分析見表5和表6。

表3 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

表4 金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響

注：+表示含有該培養(yǎng)基成分；—表示未添加該培養(yǎng)基成分。

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

注：X1～X8分別代表CMC-Na、(NH4)2SO4、KH2PO4、FeSO4、NaCl、InSO4和CaCO3的質(zhì)量濃度(g/L)。

由表5～6可知：影響Streptomycessp.S10A09產(chǎn)纖維素酶活的2個(gè)顯著因素為X1和X2(P<0.05)，即CMC-Na和(NH4)2SO4質(zhì)量濃度。采用2因素3水平的CCD試驗(yàn)尋找產(chǎn)酶條件的最佳組合。R2=95.41%，R2(調(diào)整)=83.18%，說明PB實(shí)驗(yàn)擬合度較高。

2.5 中心組合試驗(yàn)

2.5.1 CCD中心組合試驗(yàn)

根據(jù)PB設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)纖維素酶活具有顯著影響的因素，采用中心組合設(shè)計(jì)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)平行3次，結(jié)果取平均值。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析使用軟件Minitab 15.0。中心組合實(shí)驗(yàn)變量水平及結(jié)果如表7所示。

表6 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平及其主效應(yīng)分析

注：T為檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量；P值為檢驗(yàn)P值，若P值小于5%，駁回歸屬假設(shè)。

表7 中心組合試驗(yàn)變量水平及結(jié)果

由表9可以看出，回歸的整體、一次項(xiàng)、二次項(xiàng)P值均小于0.05，說明都顯著有效；而交叉乘積項(xiàng)則不顯著。失擬(Lack-of-Fit)值為0.10(大于0.05)，表示二次多項(xiàng)式回歸模型正確。R2=97.33%，說明二次多項(xiàng)式回歸效果非常好。

表8 濾紙酶活的估計(jì)回歸系數(shù)

表9 濾紙酶活的方差分析

圖1和2為依據(jù)回歸方程繪出的響應(yīng)面圖。響應(yīng)面代表著兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用。

由圖1和2可見：CMC-Na(X1)對(duì)濾紙酶FPA活力的影響極其顯著，表現(xiàn)為較陡的曲面；(NH4)2SO4(X2)對(duì)FPA活力影響較小，曲面較平滑。

圖1 濾紙酶響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface figure of filter paper activity

圖2 濾紙酶響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.2 Response surface figure and contour map of filter paper activity

2.5.2 優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

根據(jù)模型預(yù)測(cè)，產(chǎn)酶最優(yōu)條件為：X1=0.128 565(2.57 g/ L)，X2=1.414 210(11.31 g/L)，此時(shí)，預(yù)測(cè)的FPA最大響應(yīng)值為126.54 U/mL。為了進(jìn)一步確證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在優(yōu)化的理論最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得FPA為125.96 U/mL，可見該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。且Strptomycessp.S10A09 產(chǎn)纖維素酶FPA接近優(yōu)化前的3倍，高于已報(bào)道的Streptomycesruber、Streptomycesnoboritoensis等菌產(chǎn)纖維素酶的活性[14-16]。

3 結(jié)論

利用PB單因素、中心組合設(shè)計(jì)與響應(yīng)面結(jié)合的方法，借助Minitab軟件分析，對(duì)放線菌Strptomycessp.S10A09 產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵條件進(jìn)行研究并得到優(yōu)化結(jié)果，最終確定Strptomycessp.S10A09液體發(fā)酵產(chǎn)生纖維素酶的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)為CMC-Na 2.57、(NH4)2SO411.31、KH2PO40.2、MgSO41、FeSO40.01。優(yōu)化后，F(xiàn)PA達(dá)到125.96 U/mL，接近優(yōu)化前的3倍。Strptomycessp.S10A09具有培養(yǎng)基簡單、可利用無機(jī)氮源以及活性較高等特點(diǎn)，有利于工業(yè)化應(yīng)用。在進(jìn)一步研究中，將對(duì)其纖維素酶蛋白進(jìn)行純化，為進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。