朱東安， 周凱鑫， 常 東， 孫景勇

無(wú)乳鏈球菌亦稱為B族鏈球菌（group BStreptococcus），常可引起肺炎、泌尿系統(tǒng)感染、軟組織感染等，無(wú)乳鏈球菌也是女性泌尿生殖道的一種重要條件致病菌，可垂直傳播感染胎兒，也是嬰兒早期嚴(yán)重感染的主要原因[1]。臨床上無(wú)乳鏈球菌對(duì)青霉素具有高度敏感性，而對(duì)于青霉素過(guò)敏的患者克林霉素、紅霉素或左氧氟沙星是重要的替代用藥，但無(wú)乳鏈球菌對(duì)這些藥物具有較高的耐藥率[2]。通常認(rèn)為耐藥質(zhì)粒的傳播是細(xì)菌耐藥性播散的重要機(jī)制，然而近年來(lái)隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，很多測(cè)序結(jié)果顯示一種廣泛存在于細(xì)菌中的可接合性轉(zhuǎn)移元件（ICE）也在細(xì)菌耐藥性的轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演了重要角色[3]。

本研究將對(duì)分離自臨床標(biāo)本中的無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行ICE檢測(cè)并對(duì)ICE陽(yáng)性菌株的耐藥性和分子流行特征進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集2017年8月－2018年4月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院微生物科臨床分離的無(wú)乳鏈球菌178株（剔除重復(fù)株），其中分離自尿路感染患者中段尿117株（86株來(lái)自門診患者，31株來(lái)自住院患者）、陰道分泌物45株（來(lái)自孕前篩查孕婦）、前列腺液12株（來(lái)自門診患者），血培養(yǎng)4株（來(lái)自住院患者）。接合試驗(yàn)受體菌為1株分離自臨床的無(wú)乳鏈球菌（sag158），其對(duì)紅霉素敏感、對(duì)左氧氟沙星耐藥，經(jīng)三代全基因組測(cè)序證實(shí)其不含ICE 結(jié)構(gòu)，多位點(diǎn)序列分型（MLST）分型為ST-19型（GenBank： CP019979）[4]。

1.1.2 主要試劑和儀器 藥敏紙片為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；VITEK MS全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品；Thermal Cycler PCR 儀和CHEF-DR Ⅲ脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定及DNA模板提取 收集的菌株由VITEK MS全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行無(wú)乳鏈球菌確認(rèn)鑒定。從孵育18～24 h的血瓊脂培養(yǎng)基上挑取10～12個(gè)菌落通過(guò)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取臨床分離的無(wú)乳鏈球菌基因組DNA備 用。

1.2.2 篩選可能攜帶ICE的菌株 以PCR方法篩選無(wú)乳鏈球菌中ICESa2603家族ICE的酪氨酸重組酶基因tyr及其特異性插入位點(diǎn)基因rplL，引物根據(jù)GenBank上公布的序列自行設(shè)計(jì)。以PCR方法篩選無(wú)乳鏈球菌中類ICESa2603家族ICE的絲氨酸重組酶基因SR以及其特異性插入位點(diǎn)基因rumA，引物根據(jù)GenBank上公布的序列自行設(shè)計(jì)。見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST與GenBank上公布的tyr、rplL基因，SR、rumA基因進(jìn)行比對(duì)。

表1 ICE PCR擴(kuò)增引物Table 1 The primers used in ampli fication of ICEs

1.2.3 MLST 根據(jù)Jones等[5]撰寫的無(wú)乳鏈球菌MLST操作方案設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增無(wú)乳鏈球菌的7個(gè)管家基因：adhP、pheS、atr、glnA、sdhA、glcK、tkt。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海邁浦有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得各管家基因位點(diǎn)的等位基因數(shù)值，并形成相應(yīng)的等位基因譜，判斷其ST型。

1.2.4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE） 根據(jù)Elliott等[6]發(fā)表的無(wú)乳鏈球菌PFGE操作方案，將包埋有細(xì)菌DNA的膠塊經(jīng)裂解、用限制性內(nèi)切酶SmaI處理后電泳，電泳參數(shù)為電壓6 V/cm，夾角120°，溫度14 ℃，電泳時(shí)間18 h，沙門菌H9812作為分子量標(biāo) 準(zhǔn)。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法對(duì)無(wú)乳鏈球菌菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù) CLSI 2018年標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果，藥敏結(jié)果采用WHONET 5.6軟件進(jìn)行分析，耐藥率比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.6 接合試驗(yàn) 根據(jù)ICE篩選陽(yáng)性的臨床無(wú)乳鏈球菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇其中15株對(duì)紅霉素耐藥、左氧氟沙星敏感的菌株作為受體菌，無(wú)乳鏈球菌sag158（紅霉素敏感、左氧氟沙星耐藥，見(jiàn)菌株來(lái)源）作為受體菌進(jìn)行接合試驗(yàn)，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn) [4] 。挑取在雙抗性平皿（含有紅霉素和左氧氟沙星）上單個(gè)生長(zhǎng)菌落，進(jìn)行菌種鑒定、PFGE、 藥敏試驗(yàn)、PCR檢測(cè)ICE重組酶基因及MLST分型以判斷接合試驗(yàn)是否成功。

2 結(jié)果

2.1 無(wú)乳鏈球菌中ICE的檢測(cè)

通過(guò)PCR篩選不同類型ICE的插入位點(diǎn)以及整合酶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)178株無(wú)乳鏈球菌中27株（15.2%）攜帶ICE（tyr、rplL基因陽(yáng)性或/和SR、rumA基因陽(yáng)性）。其中屬于ICESa2603家族的有14株（7.9%）（tyr和rplL基因陽(yáng)性）；屬于類ICESa2603家族的有19株（10.7%）（SR和rumA基因陽(yáng)性）；兩類ICE篩選皆為陽(yáng)性的有6株（3.4%）（tyr、rplL基因和SR、rumA基因均陽(yáng)性）。

2.2 MLST分型

本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增無(wú)乳鏈球菌的7個(gè)管家基因?qū)?7株攜帶ICE的菌株分為9種ST型別，其中ST-12型10株（37.0%），ST-27型4株（14.8%），ST-24型3株（11.1%）， ST-19型3株（11.1%），ST-17型2株（7.4%），ST-10型2株（7.4%），另外ST-41、ST-164、ST-15型各1株（3.7%）。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

所有178株無(wú)乳鏈球菌對(duì)青霉素均敏感，對(duì)紅霉素、克林霉素、四環(huán)素和左氧氟沙星的耐藥率分別為56.2%、41.6%、77.5%和34.3%，其中27株ICE陽(yáng)性的無(wú)乳鏈球菌對(duì)上述4種抗菌藥物的耐藥率分別為77.8%、59.3%、92.6%和14.8%；151株ICE陰性的無(wú)乳鏈球菌對(duì)上述4種抗菌藥物的耐藥率分別為52.3%、38.4%、74.8%和37.7%。見(jiàn)表2。

表2 攜帶ICE和非攜帶ICE的無(wú)乳鏈球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率Table 2 Antibiotic resistance of ICE-carrying and non-ICE-carrying S. agalactiae（%）

2.4 接合試驗(yàn)結(jié)果

藥敏結(jié)果顯示15株紅霉素耐藥ICE陽(yáng)性的臨床無(wú)乳鏈球菌中，10株菌成功地發(fā)生了紅霉素耐藥性接合轉(zhuǎn)移，見(jiàn)表3；PFGE結(jié)果顯示10株結(jié)合子的PFGE分型與受體菌（sag158）一致而與供體菌（臨床菌株）不同，見(jiàn)圖1；PCR檢測(cè)重組酶基因及結(jié)合子MLST分型證實(shí)這10株結(jié)合子中均含有相關(guān)供體菌中的重組酶基因，且結(jié)合子的ST分型與受體菌（sag 158）一致（均為ST-19）而與供體菌的臨床菌株不同（7株ST-12，3株ST-27）。見(jiàn)表4。

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)在鏈球菌（包括無(wú)乳鏈球菌）中與耐藥性相關(guān)的ICE主要為ICESa2603家族和類ICESa2603家族兩類[7-8]。ICESa2603是首次在無(wú)乳鏈球菌 2603 V/R中發(fā)現(xiàn)，其大小為54 kb左右[9]，隨后，在來(lái)自歐洲和亞洲的動(dòng)物及人類臨床分離的鏈球菌中檢測(cè)到ICESa2603家族中的其他ICE成員，由此推斷ICESa2603家族的成員在鏈球菌屬中已經(jīng)播散存在并且能夠在鏈球菌屬中水平轉(zhuǎn)移[8]，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，其數(shù)量及宿主范圍可能會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大。

ICESa2603家族的ICE包含30個(gè)保守的核心基因，在基因結(jié)構(gòu)間有3個(gè)位點(diǎn)，用于在所有ICE中插入可變DNA。ICESa2603家族編碼酪氨酸整合酶基因tyr，其在宿主菌的特異性插入位點(diǎn)為染色體上rplL基因。而類ICESa2603家族的ICE含有ICESa2603家族的大部分核心基因（30個(gè)中的28個(gè)），但它們編碼絲氨酸整合酶基因SR，其在宿主菌的特異性插入位點(diǎn)為染色體上rumA基因[7]。本研究通過(guò)PCR篩選這兩類ICE家族中特定整合酶基因（tyr和SR）及其特異性插入位點(diǎn)基因（rplL和rumA）了解臨床分離的無(wú)乳鏈球菌中ICE的流行情況，結(jié)果顯示兩類ICE家族的總檢出率達(dá)15.2%

（27/178），其中ICESa2603家族為7.9%，類ICESa2603家族為10.7%，有6株（3.4%）同時(shí)攜帶有兩個(gè)家族的ICE，說(shuō)明ICE在無(wú)乳鏈球菌中有一定的分布，需要引起我們的注意。

表3 10株接合成功的紅霉素耐藥無(wú)乳鏈球菌及其受體菌、接合子的藥敏結(jié)果Table 3 Antibiotic susceptibilities of 10 erythromycin-resistant S. agalactiae strains and their transconjugants

圖1 部分接合成功的無(wú)乳鏈球菌及受體菌、接合子的PFGE結(jié)果Figure 1 PFGE patterns of some S. agalactiae donor strains， recipients， and their transconjugants

表4 10株接合成功無(wú)乳鏈球菌及其受體菌、接合子MLST分型和ICE整合酶PCR結(jié)果Table 4 MLST typing and PCR detection of integrase genes in 10 S. agalactiae strains and their transconjugants

MLST結(jié)果表明，在本研究ICE陽(yáng)性的無(wú)乳鏈球菌中主要的克隆型為ST-12型（37.0%），其次為ST-27型（14.8%）、ST-24型（11.1%）和ST-19型（11.1%）。而來(lái)自上海、廣州和北京的研究均顯示臨床分離的無(wú)鏈球菌（未區(qū)分是否攜帶ICE）其MLST分型主要為ST-19型[10-12]，由于本研究未對(duì)ICE陰性無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行MLST分型的檢測(cè)，且ICE篩選陽(yáng)性菌株的總樣本量較少，ICESa2603家族和類ICESa2603家族中的ICE在無(wú)乳鏈球菌中的分布與ST-12型克隆菌株是否具有相關(guān)性，還需進(jìn)一步探討。

ICE能夠自身編碼重組和接合轉(zhuǎn)移所需的全部功能，并攜帶多樣化附屬功能基因（如抗生素和重金屬抗性基因、毒力基因等）從供體菌的染色體自身切割環(huán)化后接合重組到受體菌染色體某些特定或非特定區(qū)域[3]。ICESa2603家族和類ICESa2603家族的ICE可變區(qū)中往往攜帶耐重金屬、紅霉素、四環(huán)素及氨基糖苷類等藥物的基因，如erm(B)、tet(O)、aphA等[7]，目前已報(bào)道的這兩類攜帶上述耐藥基因的ICE大多數(shù)經(jīng)體外試驗(yàn)證實(shí)是可接合轉(zhuǎn)移的，從而可能導(dǎo)致臨床菌株耐藥性擴(kuò)散。如本研究的接合試驗(yàn)顯示：所選取的15株ICE陽(yáng)性且紅霉素耐藥的臨床無(wú)乳鏈球菌中，有10株可發(fā)生ICE和紅霉素耐藥性的同時(shí)接合性轉(zhuǎn)移，而在前期研究中我們對(duì)其中的1株供體菌（sag37）及其結(jié)合子進(jìn)行了染色體高通量測(cè)序分析，首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道了一種新的類ICESa2603家族的ICE，ICE sag37，該ICE插入在染色體上且同時(shí)攜帶有紅霉素、四環(huán)素及氨基糖苷類耐藥基因[7]。另外，本研究通過(guò)比較攜帶ICE菌株和非攜帶ICE菌株的藥敏情況發(fā)現(xiàn)，前者對(duì)紅霉素、克林霉素和四環(huán)素的耐藥率（分別為77.8%、59.3%、92.6%）均顯著性高于后者（分別為52.3%、38.4%、74.8%），P＜0.05，這進(jìn)一步證實(shí)ICE在臨床分離無(wú)乳鏈球菌對(duì)紅霉素、克林霉素和四環(huán)素的耐藥擴(kuò)散中可能扮演了一定角色。不過(guò)有意思的是本研究發(fā)現(xiàn)ICE陽(yáng)性菌株對(duì)左氧氟沙星的耐藥率（14.8%）卻顯著性低于ICE陰性菌株（37.7%），P＜0.05，一個(gè)可能的解釋是：革蘭陽(yáng)性球菌中，左氧氟沙星耐藥主要是由染色體DNA中喹諾酮耐藥決定區(qū)域（QRDR）上的點(diǎn)突變引起的，該耐藥性與ICE的關(guān)聯(lián)不大，本研究中ICE陽(yáng)性菌株以ST-12型多見(jiàn)，而多個(gè)研究均發(fā)現(xiàn)ST-19型無(wú)乳鏈球菌通常表現(xiàn)為左氧氟沙星的高耐藥率，而其他ST型菌株的耐藥率較低[12-13]，其原因尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，ICE在臨床分離的無(wú)乳鏈球菌中具有較高的檢出率，其可能在紅霉素、四環(huán)素等耐藥基因的水平傳播上起著一定作用，ICE陽(yáng)性菌株中的主要克隆型為ST-12型。