李博 張恒 周曼倩 朱思偉 王華慶 張詩武 王輝

放射治療是惡性腫瘤重要的治療手段，腹盆腔惡性腫瘤病人在接受放射治療中，可因輻射誘導(dǎo)小腸損傷而出現(xiàn)放射性腸炎，對惡性腫瘤病人的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，但目前臨床上缺乏有效的防護(hù)藥物[1]。一些研究[2－3]表明電離輻射可以導(dǎo)致細(xì)胞處于持續(xù)氧化應(yīng)激狀態(tài)從而下調(diào)小腸細(xì)胞自噬水平，影響細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)及保護(hù)功能。白藜蘆醇是一種天然非黃酮多酚類化合物[4]，前期研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有抗氧化、抗衰老等作用，對小鼠具有放射防護(hù)作用[5－6]。白藜蘆醇可以活化沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1），同時可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和肝激酶 B1（LKB1）從而抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的活性[7]。但白藜蘆醇能否通過抑制Akt/mTOR通路調(diào)控小腸隱窩細(xì)胞自噬發(fā)揮放射防護(hù)作用尚未見報道。本項研究擬在前期工作的基礎(chǔ)之上深入研究白藜蘆醇對小腸輻射損傷防護(hù)作用的機(jī)制，為開發(fā)相關(guān)防護(hù)藥物提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6雄性小鼠（SPF級）24只，體質(zhì)量24～26 g，8周齡 [購自中國食品藥品檢定研究院，許可證號：SCXK（京）2014－0013]。 隨機(jī)分為對照組、照射組及照射給藥組，每組各8只。白藜蘆醇用無水乙醇助溶配置成母液，避光4℃保存，給藥前用生理鹽水稀釋。照射給藥組小鼠于照射前3 d至照射后3 d每日腹腔注射（50 mg/kg）；對照組和照射組給予同等體積生理鹽水腹腔注射。參考相關(guān)研究[8－9]，照射組及照射給藥組小鼠均接受6MV－X射線全身照射，單次劑量9.0 Gy。小鼠于照射后3.5 d脫頸處死，取部分小腸組織用中性甲醛固定24 h后脫水制作石蠟塊，再取部分新鮮小腸組織予以研磨。

1.2 主要試劑 白藜蘆醇（R5010）購自美國Sigma公司，Ki67（ab15580）兔源多克隆抗體購自Abcam公司 （美國），p－Akt （4060） 兔源單克隆抗體、Akt（4691）兔源單克隆抗體、p－S6R P（5364）兔源單克隆抗體、S6RP（2217）兔源單克隆抗體、LC3A/B(12741)兔源單克隆抗體、GAPDH（5174）兔源單克隆抗體和羊抗兔二抗 （7040）均購于Cell Signaling Technology公 司 （美 國 ），Beclin1兔 來 源 多 抗（11306－1－Ap）購于 Proteintech 公司（中國），蛋白提取試劑購自于Thermo公司（美國），免疫組織化學(xué)通用SP試劑盒（SP－9000）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 組織學(xué)分析 由小鼠空腸組織制作的石蠟塊經(jīng)切片為5μm后行HE染色，于鏡下分析。每只小鼠至少測量30根小腸絨毛長度，至少計數(shù)50個完整小腸隱窩中的隱窩細(xì)胞總數(shù)，計數(shù)每只小鼠10個小腸橫斷面中隱窩數(shù)目，所有數(shù)據(jù)計算平均值。采用SP兩步法行免疫組織化學(xué)染色，檢測小腸組織內(nèi)Ki67表達(dá)情況，鏡下每只小鼠至少計數(shù)60個完整小腸隱窩的陽性細(xì)胞數(shù)及隱細(xì)胞總數(shù)并計算平均值，統(tǒng)計小腸隱窩細(xì)胞Ki67表達(dá)陽性率。

1.4 蛋白印跡檢測相關(guān)蛋白 取新鮮空腸組織100 mg勻漿后提取小腸組織總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，等量上樣，分別用10%和15%的SDS－PAGE凝膠電泳分離，蛋白轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂牛奶封閉后選取最佳濃度一抗 （p－Akt，1∶2 000；Akt，1∶1 000；p－S6RP，1∶1 000；S6RP，1 ∶1 000；LC3A/B，1 ∶1 000；GAPDH，1 ∶1 000；Beclin 1，1∶1 000）4℃孵育過夜， 洗膜后用辣根標(biāo)記的二抗（1∶3 000）孵育 2 h，洗膜后 ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，Bio－rad全自動凝膠成像系統(tǒng)顯影拍照，采用Image J 1.4軟件 （National Institutes of Health公司，美國）對條帶分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Kolmogorov－Smirnov法對數(shù)據(jù)行正態(tài)分布檢驗，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用ANOVA方差分析，方差齊時用LSD-t法，方差不齊用 Dunnett’s T3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)檢測結(jié)果比較 與對照組相比，照射組和照射給藥組的小鼠小腸絨毛長度、單個橫斷面隱窩數(shù)、小腸隱窩細(xì)胞總數(shù)及Ki67陽性率均顯著下降（均P＜0.05）；照射給藥組小鼠上述數(shù)據(jù)均高于照射組（均P＜0.05），詳見表1。各實驗組小腸組織病理切片HE染色見圖1A，Ki67免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖1B。

表1 3組小鼠組織病理學(xué)結(jié)果比較

圖1 3組小鼠小腸組織HE染色及Ki67免疫組織化學(xué)染色 （A1－A3：HE染色，×100。B1－B3：SP兩步法Ki67免疫組織化學(xué)染色，×200；染色呈棕色細(xì)胞為Ki67表達(dá)陽性）。A1、B1圖為對照組，小腸各級結(jié)構(gòu)正常，絨毛完整，隱窩排列整齊，大部分隱窩細(xì)胞為Ki67陽性。A2、B2圖為照射組，小腸黏膜水腫，隱窩結(jié)構(gòu)紊亂，絨毛脫落，Ki67陽性隱窩細(xì)胞較少。A3、B3圖為照射給藥組，小腸絨毛及隱窩結(jié)構(gòu)較照射組完整，Ki67陽性隱窩細(xì)胞較照射組增加。

2.2 小腸Akt/mTOR通路活性比較 照射組和照射給藥組p－Akt、p－S6RP相對表達(dá)量均高于對照組（t=21.535，t=10.593，均 P＜0.001），照射給藥組p－Akt、p－S6RP 相對表達(dá)量低于照射組（t=－11.521，t=－6.468，P＜0.001），見表 2。 Akt/mTOR 通路相關(guān)蛋白的相對表達(dá)情況見圖2。

2.3 自噬相關(guān)蛋白水平比較 照射組LC3－II、Beclin1相對表達(dá)量低于對照組（t=－15.131，t=－27.588，均P＜0.001）和照射給藥組（t=21.315，t=－14.774，均 P＜0.001），見表 2。3組小鼠小腸自噬相關(guān)蛋白 LC3－II、Beclin 1的表達(dá)情況見圖3。

表2 3組小鼠小腸組織中相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較

圖2 3組小鼠小腸組織Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況（A圖，蛋白電泳圖；B圖，p－Akt/Akt相對表達(dá)量柱狀圖；C 圖，p－S6RP/S6RP 相對表達(dá)量柱狀圖；*P＜0.05）。

3 討論

放射性腸炎是腹盆腔惡性腫瘤放射治療的常見并發(fā)癥，主要因長期大劑量射線導(dǎo)致小腸的組織結(jié)構(gòu)被破壞而誘發(fā)。研究[2]發(fā)現(xiàn)程序性細(xì)胞死亡——自噬，對小腸輻射損傷具有重要的調(diào)控作用。當(dāng)處于正常水平時，細(xì)胞內(nèi)的自噬有利于清除細(xì)胞內(nèi)受損或者多余細(xì)胞成分，從而維持細(xì)胞應(yīng)激情況下的營養(yǎng)及能量供應(yīng)[11]，然而過度激活的自噬則會導(dǎo)致組織損傷，因此根據(jù)激活的程度和種類不同，自噬對機(jī)體可發(fā)揮促進(jìn)保護(hù)或誘導(dǎo)損傷的雙向作用[12]，但其機(jī)制尚未完全探明。由于電離輻射可導(dǎo)致小鼠小腸細(xì)胞的持續(xù)氧化應(yīng)激，進(jìn)而下調(diào)自噬相關(guān)通路的活性，從而造成小腸損傷。mTOR是PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路中的重要環(huán)節(jié)，可整合營養(yǎng)、能量及生長因子等多種細(xì)胞外信號，調(diào)控細(xì)胞存活、生長、蛋白質(zhì)合成、增殖和自噬等過程[13]。在Akt信號的調(diào)節(jié)下，mTOR可抑制Atg13和Atg1結(jié)合形成自噬體，從而抑制自噬體膜的形成，抑制自噬[14]。

有研究[4,10]表明，白藜蘆醇具有抗氧化、抗衰老作用，可以有效改善輻射誘導(dǎo)的小鼠骨髓功能抑制、免疫系統(tǒng)損傷；白藜蘆醇可活化SIRT1，同時可以通過激活A(yù)MPK和LKB1來抑制mTOR的活性[7]。在此基礎(chǔ)上，本研究探討了白藜蘆醇能否通過抑制Akt/mTOR通路調(diào)控小腸隱窩細(xì)胞的自噬，而對小腸輻射損傷發(fā)揮防護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，小鼠接受9 Gy劑量的X射線全身照射后，可觀察到小腸隱窩細(xì)胞數(shù)量減少和增殖能力降低、小腸絨毛損傷；在接受相同劑量X線照射的情況下，與照射組相比，白藜蘆醇持續(xù)干預(yù)使小鼠的小腸絨毛長度、隱窩細(xì)胞數(shù)目、單個橫斷面隱窩數(shù)及隱窩細(xì)胞Ki67陽性率均顯著增加，說明白藜蘆醇可有效改善電離輻射導(dǎo)致的小腸損傷。

與照射組小鼠相比，白藜蘆醇干預(yù)后的受照射小鼠小腸組織的p－Akt、p－S6RP表達(dá)下降，說明白藜蘆醇抑制了受照小鼠小腸組織Akt/mTOR通路活性。白藜蘆醇干預(yù)后受照射小鼠小腸組織自噬相關(guān)的標(biāo)志性蛋白LC3－Ⅱ、Beclin1表達(dá)較照射組小鼠增加，提示白藜蘆醇可上調(diào)受照小鼠小腸細(xì)胞的自噬水平，而自噬水平的適當(dāng)上調(diào)有助于細(xì)胞的防護(hù)作用[15]。本研究結(jié)果提示，白藜蘆醇可對小腸輻射損傷發(fā)揮防護(hù)作用，其改善小腸輻射損傷的機(jī)制可能是通過mTOR依賴途徑調(diào)節(jié)小腸細(xì)胞的自噬水平，而上調(diào)后的自噬作用為受照小腸隱窩細(xì)胞提供營養(yǎng)及能量供應(yīng)，改善了其增殖能力。

本研究表明，白藜蘆醇通過Akt/mTOR途徑對自噬水平的適度調(diào)控可能是其改善小腸輻射損傷的關(guān)鍵機(jī)制，今后的輻射損傷防護(hù)相關(guān)研究中，如何適度調(diào)控自噬可作為進(jìn)一步研究的方向。由于自噬復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制尚未探明，白藜蘆醇上調(diào)小腸細(xì)胞自噬水平的過程，是否還有mTOR以外的途徑參與有待進(jìn)一步研究。此外，電離輻射可導(dǎo)致小腸的急性損傷與慢性損傷，兩者具有不同的分子機(jī)制[1]。本的僅局限于輻射誘導(dǎo)小腸急性損傷進(jìn)行研究，在慢性損傷中白藜蘆醇是否具有相同的防護(hù)機(jī)制仍有待研究。

圖3 3組小鼠小腸組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況 （A圖，蛋白電泳圖；B圖，LC－3II蛋白相對表達(dá)量柱狀圖；C圖，Beclin1蛋白相對表達(dá)量柱狀圖，*P＜0.05）。