李曉娟 李浩 馬永壯 閆吉元 張俊 馬天 劉朝旭 楊勇 任曄 吳華

軟骨組織是一種特殊形式的結締組織，不含神經纖維、血管及淋巴管，并受各種內分泌、旁分泌激素及復雜的局部信號環(huán)路的調控［1］。氧是細胞新陳代謝的重要能量來源，組織中所需要的氧主要依靠血管運輸。由于軟骨組織無血管，因此在軟骨組織中氧分壓較其他組織低，在生理條件下軟骨細胞對低氧表現出良好的適應能力。然而在體外細胞實驗中，軟骨細胞在培養(yǎng)過程中難以保持其表型的穩(wěn)定性而出現包括成纖維樣改變、細胞外基質成分的大量丟失等［2］，從而給軟骨細胞的研究帶來了很大的困難，這也是軟骨組織工程中自體軟骨移植應用的主要缺點之一。其中生長板軟骨細胞在缺氧微環(huán)境中如何維持正常的生理功能，及其涉及信號通路尚未完全明了。

缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor?1,HIF?1）是由氧調節(jié)性的α亞基和恒定表達的β亞基組成的轉錄因子。HIF?1α是軟骨細胞對缺氧反應中重要的介導因子，并可上調一系列細胞因子從而介導軟骨細胞分化、增殖、遷徙等，其中包括血管內皮細胞生長因子，對維持軟骨細胞的穩(wěn)態(tài)和功能具有重要意義［3］。

Yes相關蛋白（Yes?associated protein,YAP）是組織穩(wěn)態(tài)、器官發(fā)育和腫瘤形成的核心調控因子。當經典的Hippo信號被激活，哺乳動物Ste20類似蛋白激酶 1/2（mammalian Ste20 like protein kinase1/2，MST1/2）被磷酸化并與salvador相互作用磷酸化大腫瘤抑制同源體（large tumor suppressor homologue,LATS1/2）激酶，磷酸化的LATS1/2激酶被激活，激活后的LATS1/2激酶磷酸化下游的YAP致使YAP失活。磷酸化Yes相關蛋白（p?Yes?associated protein，P?YAP）與14?3?3結合并被蛋白酶體泛素化降解。去磷酸化的YAP入核并主要與TEA結構域轉錄因子（TEAD）家族轉錄因子相互作用而誘導目標基因的表達［4，5］。YAP1是軟骨祖細胞增殖和維持所必須的，并能夠促進早期軟骨細胞的增殖［6］。YAP1可通過抑制Ⅹ型膠原α鏈（Collagen10α1,Col10α1）表達和與 Runt相關轉錄因子 2（runt?related transcription factor 2,Runx2）相互作用從而抑制軟骨細胞肥大。但是，YAP在生長板軟骨細胞缺氧條件中的作用尚有爭議。

考慮到YAP參與軟骨細胞的發(fā)育、分化，我們猜測YAP可能通過與HIF?1α相互作用從而參與缺氧條件下軟骨細胞的分化。在此研究中，我們利用氯化鈷干預以模擬體外缺氧微環(huán)境，探索在體外實驗中氯化鈷模擬的缺氧微環(huán)境是否能夠促進YAP的激活，并且是否能夠促進軟骨表型的維持。進一步探索體外實驗中氯化鈷模擬的缺氧微環(huán)境對軟骨細胞的影響作用中YAP與HIF?1α之間的關系。

材料與方法

一、主要實驗試劑、材料和設備

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，武漢博士德公司，中國），胰酶（Gibco，美國），二型膠原酶（Invitrogen，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，Gibco，美國），青鏈霉素（100 U/ml penicillin G sodium，100 μg/ml streptomycinsulfate，Gibco，美國），Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F?12（DMEM/F?12，HyClone，美國），細胞計數試劑盒-8（CCK?8，武漢博士德公司，中國），氯化鈷（Thermo Fisher，美國），成軟骨培養(yǎng)基（賽業(yè)公司，美國），HIF?1αsiRNA（廣州銳博公司，中國），lipo2000（Thermo Fisher，美國），Opti?MEM培養(yǎng)基（Gibco，美國），蛋白酶抑制劑（武漢博士德公司，中國），磷酸酶抑制劑（武漢博士德公司，中國），RIPA裂解液（武漢博士德公司，中國），硝酸纖維素薄膜（polyvinylidene fluo?ride，PVDF，Millipore，Billerica，美國），ECL發(fā)光液（Thermo Pierce，美國），培養(yǎng)箱（21%O2，74%N2，5%CO2，飽和濕度，Thormo公司，美國），Bio?Rad曝光機（Hercules，美國），酶標儀（Eppendorf公司，德國），抗體：YAP（#14074，Cell Signaling Technology，美國），Ⅱ型膠原（Collagen 2,Col2）（ab34712，Abcam，英國），HIF?1α（ab2185，Abcam，英國），β?actin（BM5180，武漢博士德公司，中國）。

二、分離和培養(yǎng)軟骨細胞

生長板軟骨細胞取自7日齡的SD大鼠。所有動物規(guī)程遵從我院倫理委員會相關規(guī)定。SD大鼠麻醉后頸椎脫臼法處死，軟骨取自股骨遠端及脛骨近端生長板軟骨組織，用PBS漂洗后切碎至1～3 mm3大小，用0.25%胰酶消化30 min，隨后用0.1%二型膠原酶37℃消化8 h。PBS漂洗后離心收集細胞，并用含10%FBS和1%青鏈霉素的DMEM/F?12培養(yǎng)基重懸細胞后種入細胞培養(yǎng)瓶中。將細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)基。當細胞達到80%融合時，胰酶消化傳代，第3代細胞用于本實驗。

三、氯化鈷干預形成缺氧環(huán)境

首先將軟骨細胞（5 000細胞/孔）接種到96孔板中。細胞黏附24 h后，用不同濃度的氯化鈷培養(yǎng)基（0、50、100、150、200 μmol/L）處理細胞24 h。

（一）細胞活性實驗

通過使用CCK?8細胞計數試劑盒分析細胞活力。細胞干預完成后，在每孔中加入100 μl培養(yǎng)基和10 μl的CCK?8溶液。在37 ℃下再溫育1 h后，酶標儀測定其在450 nm處的吸光度。

（二）阿利新藍染色

將2×106個大鼠生長板軟骨細胞重懸于10 μl的培養(yǎng)基中，隨后將其種入6孔板中，放置培養(yǎng)箱中稍稍干燥后按分組加入2 ml培養(yǎng)基：①對照組：普通培養(yǎng)基；②成軟骨培養(yǎng)基組：成軟骨培養(yǎng)基；③氯化鈷干預組：氯化鈷濃度為10-5mol/L的普通培養(yǎng)基；④成軟骨培養(yǎng)基+氯化鈷組：含10-5mol/L氯化鈷的成軟骨培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)干預7 d后進行阿利新藍染色。

（三）Western blotting

1.濃度梯度實驗 細胞干預完成后進行West?ern blotting實驗，檢測Col2、YAP和HIF?1α蛋白的表達。干預后的細胞用預冷的PBS漂洗后，用含1%的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解軟骨細胞30 min，12 000 r/min，4℃離心，收集上清后用BCA法進行蛋白定量。取20 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后將分離的蛋白轉至硝酸纖維素薄膜上。將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h后用相應抗體4℃孵育過夜。三乙醇胺緩沖鹽+Tweenzo溶液（tris?buffered saline and tween 20,TBST）洗漂洗后室溫下孵育辣根過氧化物酶結合的二抗1 h，再次TBST漂洗后應用ECL發(fā)光液，Bio?Rad曝光機下曝光。β?actin作為內參。

2.時間梯度實驗 根據濃度梯度的實驗結果，選取最佳濃度的氯化鈷培養(yǎng)基干預軟骨細胞不同的時間梯度（0、12、24、36和48 h），然后進行Western blotting實驗，測量Col2、YAP和HIF?1α蛋白的表達，方法同上。

3.siRNA干預 當生長板軟骨細胞融合達50%左右時棄原培養(yǎng)基，加入2 ml含50 nmol/L HIF?1αsiRNA（或 50 nmol/L YAP siRNA）和 lipo2000的Opti?MEM培養(yǎng)基進行轉染6 h。轉染完成后，用100 μmol/L氯化鈷干預24 h，測量Col2、YAP和HIF?1α蛋白的表達。

四、統計學分析

所有實驗重復3次，結果以均數±標準差（）表示。統計學分析采用SPSS 19.0統計軟件（IBM公司，美國），兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用檢驗One?wayANOVA，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、氯化鈷對軟骨細胞的毒性檢測

如圖1所示，CCK?8結果顯示不同濃度的氯化鈷（50、100、150、200 μmol/L）對軟骨細胞活性并沒有明顯的影響。

圖1 氯化鈷對軟骨細胞細胞活性作用

圖2 氯化鈷促進大鼠生長板軟骨細胞細胞外基質表達

二、軟骨細胞細胞外基質的合成

如圖2所示，根據軟骨細胞微團大小可以發(fā)現，各組中軟骨細胞微團均被染成藍色；氯化鈷培養(yǎng)基組微團大小較對照組明顯增加。結果提示，氯化鈷模擬的體外缺氧環(huán)境能夠促進大鼠生長板軟骨細胞細胞外基質的合成。

三、成軟骨特異性標志物的表達

圖3的Western blotting結果顯示，氯化鈷能夠明顯上調軟骨細胞中Col2蛋白水平的表達，且濃度為100 μmol/L時效果最為明顯。因此我們隨后應用濃度為100 μmol/L的氯化鈷刺激軟骨細胞不同的時間長度（0、12、24、36、48 h），并用Western blotting方法再次檢測Col2的表達變化。結果顯示，100 μmol/L的氯化鈷能夠有效促進軟骨細胞中Col2蛋白水平表達，并且呈時間依耐性。

四、大鼠生長板軟骨細胞HIF?1α和YAP的表達

圖3的Western blotting結果顯示，在應用不同濃度的氯化鈷刺激后，YAP蛋白表達水平明顯上調，且在100 μmol/L濃度時最為明顯，但是當氯化鈷濃度達200 μmol/L時YAP的表達出現了下調。HIF?1α的表達水平變化同YAP一致。

應用100 μmol/L氯化鈷刺激后，YAP蛋白上調明顯，于24 h時到達頂峰，隨后表達出現了下調。HIF?1α蛋白表達變化與YAP保持高度一致。

五、HIF?1/YAP信號參與促進軟骨細胞表型維持

應用siRNA下調氯化鈷刺激下大鼠生長板軟骨細胞中HIF?1α表達后，圖4 Western blotting結果顯示，下調HIF?1α后，YAP表達也出現下調，并且Col2表達水平同樣出現了下調。隨后我們應用siRNA下調YAP表達后檢測HIF?1α蛋白水平變化發(fā)現，下調YAP的表達對HIF?1α蛋白水平的表達并無明顯影響。結果說明，缺氧促進的大鼠生長板軟骨細胞表型維持中，HIF?1α可能位于YAP的上游。

討 論

圖3 氯化鈷上調軟骨細胞Col2、HIF?1α和YAP蛋白的表達

圖4 氯化鈷通過HIF?1α/YAP信號促進軟骨細胞表型維持

軟骨組織中只含有軟骨細胞這一種組織細胞類型，其所需的氧主要來源于滑液。軟骨細胞可以產生維持軟骨細胞外基質平衡所需的物質，包括膠原（主要為Col2）和蛋白多糖（主要為聚集蛋白多糖）。研究表明，在體內軟骨細胞長期處于低氧微環(huán)境中，于體外培養(yǎng)時多處于相對于其生理狀態(tài)下的高氧環(huán)境中，多次傳代后軟骨細胞形態(tài)會出現改變，同時丟失軟骨特性型標記物。因此，研究軟骨細胞在缺氧微環(huán)境中的細胞反應對研究軟骨細胞的生理功能至關重要。本實驗中我們利用氯化鈷干預軟骨細胞以模擬體外的缺氧微環(huán)境。

HIF是存在于哺乳動物細胞中一類介導低氧適應反應的轉錄因子，是一種異源二聚體轉錄因子，由氧調節(jié)性的α亞基和恒定表達的β亞基組成的轉錄因子。HIF?α為功能性亞基，決定HIF的活性，受細胞內氧濃度的調節(jié)［3］。HIF?β為結構性亞基，在細胞內穩(wěn)定表達，不受氧濃度的影響和調節(jié)。在常氧條件下，HIF?α與VHL（Von Hippel?Lindau）蛋白結合，并被泛素連接酶E3受體識別，形成E3泛素連接酶復合物從而被泛素化降解。當氧濃度降低時，HIF?α通過抑制HIF抑制因子或與脯氨酸羥化酶作用增加穩(wěn)定性和轉錄活性，并與HIF?β形成二聚體結構，轉移至細胞核中調節(jié)下游基因的表達［3］。HIF?1在軟骨正常生長發(fā)育、能量代謝、存活過程中都發(fā)揮了重要作用［7?9］。常氧條件下Co2+能夠穩(wěn)定HIF?1α活性并誘導下游基因的表達［10］。在此研究中我們應用不同濃度的氯化鈷干預生長板軟骨細胞24 h后發(fā)現，HIF?1α蛋白表達水平上調。且100 μmol/L氯化鈷刺激軟骨細胞不同的時間長度后發(fā)現，HIF?1α蛋白表達水平明顯上調。說明了常氧條件下Co2+除了能夠有效地穩(wěn)定HIF?1α活性，并且呈劑量和時間依賴性。細胞缺氧狀態(tài)下，HIF?1α在能量供應、紅細胞生成、血管再生及細胞存活等方面發(fā)揮重要作用。體外的病理性缺氧能夠促進神經干細胞（neu?ral stem cell，NSC）的增殖，并上調HIF?1α表達，激活Wnt信號通路。沉默HIF?1α可降低β?catenin的核轉位和cyclinD1的表達，并抑制NSC的增殖［11］。于體外培養(yǎng)中敲除生長板軟骨細胞HIF?1α基因時，軟骨細胞增殖能力明顯減弱并出現大量死亡［12，13］。于體內實驗中特異性敲除軟骨細胞內HIF?1α基因時，軟骨細胞不能維持正常的代謝功能，胎鼠因為支氣管塌陷和肋骨發(fā)育畸形出現呼吸功能障礙而于出生前死亡［14］。當肢芽間充質干細胞缺乏HIF?1α可導致軟骨組織形成延遲［13，15］。HIF?1α能夠抑制缺氧環(huán)境下終板軟骨細胞的凋亡，從而對終板軟骨細胞起到保護作用。缺氧環(huán)境能通過HIF?1α促進Col2、蛋白多糖的表達從而促進軟骨細胞的合成代謝［16］。在此實驗中，當我們利用氯化鈷上調常氧條件下HIF?1α的表達時，Col2的表達也相應的出現了上調。這似乎表明缺氧所致Col2的上調與缺氧條件下HIF?1α的激活有關。且有研究表明，體外培養(yǎng)的人間充質干細胞予以缺氧或者HIF?1α刺激時，Col2、蛋白多糖表達增加，Col10合成減少。當去除HIF?1α刺激時Col2、蛋白多糖表達下降，Col10合成增加［17］。并且在軟骨炎中，HIF?1α能夠保護軟骨細胞免受炎性因子的攻擊［18］。

Hippo信號通路在許多的器官中起到控制器官的大小和組織再生的作用，并具有調控細胞的增殖分化等作用［4，19］。YAP被證實參與調節(jié)各種細胞過程，包括機械力傳導［20］，干細胞分化［21］等。但Hippo信號通路在軟骨細胞分化和骨修復中的作用仍然不甚明了。YAP1作為Hippo信號通路中的核心轉錄調控因子能夠直接調節(jié)性別決定區(qū)Y型高遷移率族蛋白 6（sex?determining region Y?type high mobility group box protein6，SOX6）的表達而促進軟骨細胞增殖，Teads是YAP1結合DNA所必須的轉錄因子，YAP1/Teads復合體直接誘導SOX6的表達，并且Teads與YAP1的結合是YAP1調控SOX6表達所必須的，從而YAP1介導的軟骨細胞增殖其中一部分是通過SOX6傳導的［6］，并通過與Runx2的相互作用抑制Col10α1的表達而抑制軟骨細胞成熟［22］。在胎鼠的生長板軟骨中YAP1在靜息層和增殖層表達明顯，而P?YAP1在肥大層表達明顯，并且肥大層中Col10α1和Runx2表達明顯。YAP1可抑制骨骼發(fā)育和生長過程中的軟骨細胞成熟及軟骨內成骨。YAP1是軟骨祖細胞增殖和維持所必須的。YAP1的過表達能夠增強軟骨細胞增殖能力但是會抑制其分化，并且YAP1過表達能夠激活Wnt/β?catenin信號通路，Dickkopf?1和β?catenin siRNA可部分減弱YAP1過表達對軟骨細胞系ATDC5細胞分化的影響，因此YAP1在間充質干細胞（mesenchyma stem cell，MSCs）成軟骨分化過程中起負性調節(jié)作用，下調YAP的表達有助于MSCs成軟骨分化［23］。但關于缺氧與YAP之間相互作用的研究較少，尤其是關于在軟骨細胞中缺氧與YAP之間相互作用的報道尚未見到。有研究表明缺氧能夠誘導腫瘤細胞系HEK293T，HeLa和MDA?MB?231中YAP磷酸化并下調總YAP的表達［24］。而在另外一份研究中表明缺氧能夠使Hippo信號失活，YAP表達上調并與HIF?1α形成復合物，從而穩(wěn)定HIF?1α在體內腫瘤中的表達［25］。在肝竇內皮細胞中干擾YAP顯著下調HIF?1蛋白質表達［26］。在前列腺癌中缺氧可通過增減細胞核中YAP表達和抑制P?YAP水平來提高YAP的活性［27］。

在此研究中，我們利用HIF?1α的激動劑氯化鈷于常氧條件下刺激軟骨細胞后發(fā)現，氯化鈷能夠有效促進軟骨細胞細胞外基質表達。并且利用不同濃度氯化鈷刺激軟骨細胞時發(fā)現軟骨細胞內Col2表達明顯上調，并且這種上調呈時間和濃度依耐性。氯化鈷同時能夠上調軟骨細胞中YAP的表達，且具有濃度和時間依賴性。當氯化鈷濃度超過一定值或者干預超過一定時間長度時，這種促進作用出現了明顯的下調。與此同時，當下調HIF?1α的表達后氯化鈷促進YAP表達的上調出現減弱。因此我們推測氯化鈷模擬的缺氧環(huán)境能夠通過HIF?1α/YAP信號促進軟骨細胞軟骨表型的維持。但具體為哪種亞型軟骨細胞在此過程中起到主導作用有待進一步細胞及動物實驗研究。

氯化鈷能夠促進YAP的激活，并且是HIF?1α依賴性的，下調HIF?1α的表達能夠抑制氯化鈷所致的YAP的激活和軟骨細胞表型的維持。最重要的是，我們的研究表明缺氧環(huán)境通過HIF?1α和YAP之間相互作用從而最終影響軟骨細胞表型的維持。這也許可為軟骨組織工程中軟骨細胞制備提供一個新的思路或靶點。但本實驗存在缺乏對HIF?1α和YAP結合位點研究，及缺乏體內實驗部分等眾多不足。