靳文娟，謝娟平，魚亞楠，王 磊

(安康學(xué)院 秦巴中藥資源研發(fā)中心, 陜西 安康 725000)

安康紫陽屬于中國最古老的北緣茶區(qū)，種茶歷史悠久，始于商周，興于盛唐，是中國最早的貢茶產(chǎn)地，加之紫陽地區(qū)土壤富硒，茶葉達(dá)到了富硒標(biāo)準(zhǔn)，紫陽富硒茶品質(zhì)優(yōu)良[1]。紫陽縣現(xiàn)有茶園面積1.47萬hm2，年產(chǎn)茶葉7 000余t，發(fā)展茶企300余家，茶葉的深加工是提高紫陽富硒茶綜合利用的有效途徑之一[2]。

綠茶的主要活性物質(zhì)中，茶多酚(TP，約占茶葉干重的15%～25%)是形成茶葉色香味的主要成份之一，也是茶葉中有保健功能的主要成份之一，具有強(qiáng)的抗氧化和抗輻射作用[3]；茶氨酸(N-乙基-L-谷氨酰胺)是茶葉中特有的游離氨基酸，在干茶中占重量的1%～2%，具有調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)傳達(dá)物質(zhì)的變化、降血壓等作用[4～5]。

目前，茶多酚提取多以50%～70%的乙醇[6]或蒸餾水超聲輔助提取[7～8]、微波輔助提取[9]或超臨界流體提取[10]等為主，以高濃度(80%)乙醇冷浸提取的報(bào)道較少，茶氨酸的提取主要以加熱蒸餾水提取為主[11～13]，為了提高茶氨酸的提取率，綜合考慮茶多酚的提取，筆者設(shè)計(jì)了80%乙醇冷浸提取和超聲波輔助提取相結(jié)合的分級(jí)提取工藝，同時(shí)，設(shè)計(jì)分離純化工藝[14～15]，分別得到了茶多酚和茶氨酸粉末，為提高安康紫陽富硒茶的綜合利用率提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

超聲波清洗器KH2200E(超聲頻率40KHz,超聲功率80W，加熱功率600W)昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-52AA，上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司，傅立葉紅外光譜儀FT-IR200美國Nicolet公司，雙光束紫外-可見分光光度計(jì)，SP-1900，上海光譜儀器有限公司，高效液相色譜SPD-10AVP 日本島津，玻璃器包括：滲漏器、分液漏斗等。

茶葉為陜西省安康市本地紫陽富硒茶，茶氨酸標(biāo)品購自北京索來寶生物科技有限公司；二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、茚三酮、氯化亞錫、丙酮、溴化鉀、甲醇均為分析純，購自天津市百世化工有限公司，聚酰胺(200-400目)樹脂、732型陽離子交換樹脂購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司、DEAE纖維素DE-52樹脂購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 茶多酚、茶氨酸的分級(jí)提取分離 取低溫烘干后的茶葉5.0 g，粗粉碎(過60目篩)，以料液比為1:25入80 % 的乙醇溶液125 mL于滲漏器中，浸泡24 h后，收集初漏液，再添加80% 的乙醇溶液，滲漏速度2 mL·min-1，收集續(xù)漏液，合并兩次滲漏液，0.08 MPa、50 ℃減壓濃縮，回收乙醇。

濾渣烘干后，稱重為3.1207 g，加入100 mL蒸餾水，在超聲波輔助條件下，70 ℃提取30 min，過濾，濾渣再加入50 mL蒸餾水，同樣條件下提取30 min，合并濾液，0.08 MPa、75 ℃減壓濃縮。

1.2.2 冷浸提液中茶多酚和茶氨酸的分離純化 乙醇冷浸提取濃縮液用等體積乙酸乙酯萃取兩次，取上層液體減壓濃縮，回收乙酸乙酯后，逐滴滴加過預(yù)處理過的聚酰胺樹脂，柱內(nèi)保留時(shí)間為30 min，先用1.5倍體積的去離子水洗脫去除咖啡因，再用1.5倍柱體積的85%乙醇洗脫，將洗脫液用膠頭滴管每次吸取少量液體逐滴滴加過AB-8樹脂，柱內(nèi)保留時(shí)間30 min，用1.5倍柱體積的85%乙醇洗脫得到淡黃色液體，減壓濃縮回收乙醇，減壓濃縮，低溫干燥得到茶多酚粉末0.7420 g，得率14.84%。

乙酸乙酯萃取后的下層萃取液，減壓蒸餾，去除少量乙酸乙酯后，過732型陽離子交換樹脂，用pH=8的磷酸鹽溶液洗脫，收集洗脫液。

1.2.3 濾渣超聲水提液中茶氨酸的分離純化 將80%乙醇浸提后的茶葉渣(3.1207 g)，加水80 mL、70℃超聲輔助浸提50 min，提取2次，取濾液減壓濃縮后過DEAE樹脂，柱內(nèi)保留時(shí)間為30 min，流出液用膠頭滴管每次吸取少量液體逐滴滴加至732型陽離子交換樹脂，用pH=8的磷酸鹽溶液洗脫，得到洗脫液為茶氨酸富集液，合并冷浸提液萃取柱分離處理后的洗脫液，低溫烘干，得到白色粉末0.0407g，得率0.814%。

圖1 茶多酚、茶氨酸的分級(jí)提取、分離純化流程

1.3 紅外光譜表征

采用KBr壓片法，分別對(duì)從安康紫陽富硒茶中分級(jí)提取分離得到的茶多酚樣品、茶氨酸樣品進(jìn)行紅外光譜分析，明確特征官能團(tuán)的吸收峰。

1.4 含量的測(cè)定

1.4.1 茶多酚含量測(cè)定 建立高效液相色譜法條件，對(duì)乙醇冷浸提液和超聲水提取液中茶多酚的含量進(jìn)行分析。高效液相色譜條件：C18色譜柱，柱溫25 ℃，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)279 nm，流動(dòng)相：A:甲醇；B:0.1%磷酸水溶液(A:B = 28:72)，流速1.0 mL·min-1。

標(biāo)品溶液的制備：精密稱取茶多酚標(biāo)品粉末25.0 mg，于50 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解后，置于超聲條件下30 min，定容，以0.45μm 微孔濾膜濾過，濾液作為樣品儲(chǔ)備液備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定，分別取標(biāo)品儲(chǔ)備液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL、12 mL定容至25 mL，取10μL 進(jìn)樣。

樣品溶液的制備：冷浸提液和超聲水提取液，各取10 mL，以0.45μm 微孔濾膜濾過，濾液作為樣品供試液，取1μL 進(jìn)樣。

1.4.2 茶氨酸含量的測(cè)定 采用茚三酮比色法測(cè)定茶氨酸的含量。

標(biāo)品的制備：準(zhǔn)確稱取茶氨酸標(biāo)品5.0 mg，加1 mL蒸餾水加熱溶解，定容至25 mL。

茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別取標(biāo)品溶液0、1、2、3、4、5 mL，加PH=8的磷酸鹽緩沖溶液2 mL，2%茚三酮溶液 1mL，沸水加熱15 min，自然冷卻10 min，加蒸餾水定容至25 mL，570 nm處測(cè)吸光度。

分別取冷浸提液3 mL、超聲水提取液3 mL，加緩沖溶液2 mL，2%茚三酮溶液 1mL，沸水加熱15 min，自然冷卻10 min，加蒸餾水定容至25 mL，570 nm處測(cè)吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

對(duì)分級(jí)分離純化后所得的茶多酚和茶氨酸粉末進(jìn)行紅外光譜分析。

茶多酚樣品的紅外光譜圖如圖2所示，在3 200～3 600 cm-1的寬吸收峰為苯環(huán)上的羥基吸收峰，1 300～1 350 cm-1是茶多酚中表兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素沒食子酸酯的酯基吸收峰，1 000～1 300 cm-1左右為羥基的變形振動(dòng)，700～850 cm-1處可能是由1,3二取代苯上的-C-H變形振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰。

茶氨酸樣品的紅外光譜圖如圖3所示，3 300～3 500 cm-1的吸收峰為酰胺鍵上N-H的伸縮振動(dòng)，2 850～3 000 cm-1的寬吸收峰為-CH3基、-CH2基的伸縮吸收，1 500～1 750 cm-1的吸收峰為C=O的伸縮振動(dòng)，1 000～1 350 cm-1左右為C-N伸縮振動(dòng)吸收。

圖2 茶多酚樣品紅外光譜

圖3 茶氨酸樣品紅外光譜

2.2 含量測(cè)定數(shù)據(jù)及分析

2.2.1 茶多酚標(biāo)品的高效液相圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 茶多酚標(biāo)品的高效液相圖譜

圖5 茶多酚標(biāo)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相條件下，測(cè)得茶多酚標(biāo)品的高效液相色譜圖如圖4所示，共有7個(gè)峰反應(yīng)了茶多酚的主要組成，采用保留時(shí)間定性，面積加和后進(jìn)行外標(biāo)法計(jì)算含量，茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到乙醇浸提液和超聲水提液中茶多酚的含量分別為0.7162 g(占茶葉原重的14.32%)和0.03949 g(占茶葉原重的0.7898%)。

2.2.2 茶多酚和茶氨酸的含量分析 由表2的數(shù)據(jù)可見，采用80%乙醇提取和超聲輔助水提的分級(jí)提取方法，在乙醇浸提液中茶多酚的含量為716.1132 mg，茶氨酸的含量為11.7589 mg；超聲濾渣超聲水提液中茶多酚的含量為39.4878 mg，茶氨酸的含量為38.4665 mg。實(shí)驗(yàn)共稱取了5.0 g 安康紫陽富硒茶，采用分級(jí)提取的方法可知：茶多酚的總含量為755.6010 mg，占茶葉總重量的15.11%；茶氨酸的總含量為50.2254 mg，占茶葉總重量的1.005%。

表1 茶多酚含量的高效液相數(shù)據(jù)

表2 茶多酚、茶氨酸含量數(shù)據(jù)

注：百分提取率為含量占茶葉原質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)。

3 結(jié)論

茶多酚和茶氨酸是茶葉的主要活性物質(zhì)，也是提高茶葉綜合開發(fā)利用價(jià)值的主要產(chǎn)品，安康茶葉資源豐富，紫陽富硒茶(綠茶)是安康茶葉中的佼佼者，為了提高其中茶多酚和茶氨酸的綜合提取率，本文設(shè)計(jì)了乙醇(85%)冷浸提取和超聲水提相結(jié)合的分級(jí)提取方式，建立了高效液相分析法和茚三酮顯色法分析法相結(jié)合的表征方法，分別檢測(cè)分級(jí)提取液中茶多酚和茶氨酸的含量，可為下一步分離純化提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

分析得到的含量數(shù)據(jù)可知：冷浸提法一級(jí)提取液中茶多酚的含量高，占到茶葉干重的15.11%，同時(shí)有少量茶氨酸可從中分離得到；冷浸提后的濾渣經(jīng)過超聲輔助水提后，可得到二級(jí)提取液，其中茶多酚的含量低(占茶葉干重的0.7898%)，茶氨酸含量占茶葉干重的1.005%。提取液經(jīng)萃取和柱分離相結(jié)合的方式純化后，干燥，得到茶多酚粉末0.7420 g，得率14.84%，茶氨酸白色粉末0.0407g，得率0.814%。該分級(jí)提取工藝實(shí)現(xiàn)了茶多酚和茶氨酸的綜合提取，提取效率高，設(shè)備簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，具有一定的小試放大價(jià)值。