張 蓓，鄭 翔，黃 維，陳亞華，沈振國，陸 巍

(南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，江蘇南京 210095)

隨著現(xiàn)代工業(yè)的飛速發(fā)展和礦產(chǎn)資源的過度開發(fā)，各種污染物不斷排放，土壤環(huán)境污染問題日益嚴重，其中重金屬污染因其具有富集性、難降解、毒性強的特點而受到廣泛關(guān)注。我國有接近0.2億hm2的農(nóng)田遭受著不同程度的重金屬污染，每年因受重金屬污染而減產(chǎn)的糧食約有1 000萬t，合計損失達200億元[1]。尚二萍等[2]研究表明，中國糧食主產(chǎn)區(qū)耕地土壤重金屬污染點位超標率平均為21.49%，污染物以Cd、Ni、Cu、Zn 和Hg 為主，Cd污染比重最高，達到了17.39%，且耕地土壤重金屬含量呈增加趨勢。

Cd是植物生長的非必需元素，Cd2+被植物根部吸收并被運輸至地上部分，在植物體內(nèi)積累到一定水平后，會造成植物生理生化代謝紊亂，導致植物抗逆性降低，甚至造成植株死亡[3-6]。小麥(TriticumaestivumL.)是我國第二大糧食作物，其產(chǎn)量和質(zhì)量直接關(guān)系國民經(jīng)濟的發(fā)展和人民的日常生活。孟自力等[7]研究指出，0.4～1.2 mmol·L-1的Cd2+對小麥種子萌發(fā)和幼苗生長有顯著抑制作用；不同小麥品種、不同種植區(qū)域?qū)︽k脅迫的響應(yīng)存在差異。因此，明確Cd2+脅迫對小麥幼苗生長的影響及外源物質(zhì)緩解Cd2+毒害的機制對小麥安全生產(chǎn)具有重要作用。

硫化氫(H2S)是一種具有臭雞蛋氣味的氣體，已被確定為動物中繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后發(fā)現(xiàn)的第三種信號分子，參與哺乳動物的生理調(diào)節(jié)和疾病反應(yīng)[8-10]，植物體內(nèi)也能合成少量的H2S，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育[11]。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)外源H2S能夠提高植物對重金屬脅迫的抵抗能力，如H2S通過增強ATPase活性、減少Al3+的吸收以及提高抗氧化能力來緩解Al對大麥的毒害作用[12]；H2S調(diào)控AsA-GSH循環(huán)，緩解豌豆所受的As毒害[13]；H2S通過調(diào)節(jié)半胱氨酸(Cys)代謝相關(guān)基因的表達，參與Cr6+誘導擬南芥中Cys含量增加的過程，并且H2S和Cys共同緩解Cr6+對擬南芥根長的抑制，同時上調(diào)PCS1和PCS2表達，增加金屬硫蛋白和植物螯合肽的含量，提高擬南芥對Cr6+的耐受性[14]。Mostofa等[15]研究顯示，250和500 μmol·L-1的CdCl2處理嚴重抑制水稻幼苗的生長，而添加100 μmol·L-1的NaHS能夠提高抗氧化酶活性，減輕氧化傷害，維持離子平衡，緩解Cd2+對水稻幼苗生長的抑制。此外，H2S預處理可減少胡楊胞質(zhì)中的Cd，增加Cd在胡楊液泡中的比例，緩解Cd誘導的細胞程序性死亡[16]。

目前，H2S對Cd2+脅迫下的小麥幼苗的生理生化影響和作用機理尚不清楚，尤其是在光合特性方面了解較少。本試驗利用硫氫化鈉(NaHS)作為H2S的外源供體，水培小麥幼苗至一葉一心期，添加不同濃度的NaHS預處理5 d，再用50 μmol·L-1CdCl2繼續(xù)處理5 d，然后收苗測定各項生理生化指標，研究外源H2S對Cd2+脅迫下的小麥幼苗生長、光合、葉綠素熒光、Cd含量和抗氧化特性的影響，揭示H2S提高小麥幼苗耐Cd特性的作用機制，為小麥Cd污染的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為江蘇省淮南麥區(qū)廣泛種植的小麥品種蘇科麥一號。硫氫化鈉(NaHS)為H2S的供體，DL-炔丙基甘氨酸(PAG)為催化H2S合成的L-半胱氨酸脫巰基酶的抑制劑，均購于SIGMA(Sigma-Aldrich,Shanghai)，常規(guī)化學試劑(分析純)購于國內(nèi)化學試劑廠家(索萊寶科技有限公司、國藥集團化學試劑有限公司、上海源葉生物科技有限公司等)。

1.2 試驗方法

1.2.1 最佳NaHS濃度選擇

挑選飽滿一致的小麥種子用2.5%(v/v)次氯酸鈉(NaClO)溶液消毒30 min，沖洗干凈，在28 ℃的培養(yǎng)箱中遮光催芽。發(fā)芽后，換用1/2 Hoagland營養(yǎng)液，晝夜溫度為26/18 ℃，光暗周期為16/8 h，光照強度為300 μmol·m-2·s-1，每隔1 d更換一次營養(yǎng)液。待小麥幼苗長至一葉一心期，挑選長勢一致的小麥幼苗移至塑料杯中培養(yǎng)，隨機分為6組，其中4組用含不同濃度NaHS(10、50、100和200 μmol·L-1)的Hoagland營養(yǎng)液預處理5 d，然后用含50 μmol·L-1的CdCl2的Hoagland營養(yǎng)液繼續(xù)處理5 d；以Hoagland營養(yǎng)液處理5 d后，用含50 μmol·L-1CdCl2的Hoagland營養(yǎng)液處理5 d為Cd對照組；剩余組以Hoagland營養(yǎng)液處理10 d，為空白對照組。每個處理設(shè)置3個重復，處理結(jié)束后取測定部分生長、生理生化指標和Cd含量。

1.2.2 最佳外源NaHS對小麥活性氧(ROS)和非蛋白巰基(NPTs)含量的影響

由1.2.1確定最佳NaHS濃度后進行以下4組不同的處理：(1)Hoagland處理10 d的空白對照組(Control)；(2)NaHS處理5 d+Hoagland處理5 d(NaHS)；(3)Hoagland處理5 d+CdCl2處理5 d(Cd)；(4)NaHS處理5 d+CdCl2處理5 d(NaHS+Cd)，處理結(jié)束后取倒二葉進行活性氧(ROS)和非蛋白巰基(NPTs)含量測定。處理時期和方法同1.2.1。

1.2.3 NaHS影響小麥生長的機理研究

為探究NaHS對小麥生長的影響機理，用1.2.1中篩選的最佳NaHS濃度進行8組處理：(1)Hoagland處理10 d為空白對照(Control)；(2)NaHS處理5 d+Hoagland處理5 d(NaHS)；(3)PAG處理5 d+Hoagland處理5 d(PAG)；(4)NaHS+PAG處理5 d+Hoagland處理5 d(NaHS+PAG)；(5)Hoagland處理5 d+CdCl2處理5 d(Cd)；(6)NaHS處理5 d+CdCl2處理5 d(NaHS+Cd)；(7)PAG處理5 d+CdCl2處理5 d(PAG+Cd)；(8)NaHS+PAG處理5 d+CdCl2處理5 d(NaHS+PAG+Cd)。PAG的濃度設(shè)為1 mmol·L-1，培養(yǎng)方法同1.2.1；處理結(jié)束后測定各項指標。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 幼苗生長指標與Cd含量的測定

各處理隨機挑選15株小麥幼苗，測量幼苗地上部和地下部的長度以及鮮重(FW)。將材料分為新葉、老葉、莖、根，置于105 ℃烘箱中殺青30 min，80 ℃下烘干至恒重(DW)；Cd含量的測定參照Zhao[17]的方法，用V(HNO3)∶V(HClO4)=87∶13的混合酸消煮樣品，用2.5%稀HNO3定容，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀ICP(Perkin Elmer Optima 2100DV,USA)測定Cd含量。Cd的轉(zhuǎn)運系數(shù)定義為地上部Cd濃度與根部Cd濃度比值。

1.3.2 幼苗生理生化指標的測定

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進行ANOVA分析，采用Duncan test進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaHS預處理對Cd2+脅迫下小麥幼苗生長的影響

與對照相比，不同濃度的NaHS預處理5 d對小麥幼苗的生長無明顯影響(表中未列出)；而Cd2+脅迫幼苗的生長受到顯著抑制(表1)，其中幼苗株高降低20.3%，根長降低22.3%，整株鮮重降低25.4%，整株干重降低24.6%。50和100 μmol·L-1的NaHS預處理能夠顯著緩解Cd2+脅迫小麥幼苗地上部生長的抑制，與Cd2+對照相比，株高分別增加6.7%和5.1%，鮮重分別增加21.9%和17.8%，干重分別增加19.8%和13.6%，而不同濃度的NaHS預處理下根長差異不顯著。說明一定濃度的外源H2S預處理能夠有效緩解Cd2+對小麥幼苗生長造成的抑制作用，對地上部分的作用效果更明顯。

2.2 不同濃度NaHS預處理對Cd2+脅迫下小麥幼苗葉片光合色素和凈光合速率的影響

10、50、100 μmol·L-1NaHS預處理5 d時小麥幼苗葉片中的總?cè)~綠素含量、類胡蘿卜素含量以及凈光合速率(Pn)與空白對照無顯著差異，200 μmol·L-1NaHS預處理5 d時小麥葉片的總?cè)~綠素含量和Pn較空白對照顯著降低(P<0.05，表中未列出)。如表1所示，與空白對照比較，Cd2+脅迫下幼苗的葉綠素含量、類胡蘿卜素含量和Pn均顯著降低，分別下降了28.4%、20.7%和21.7%。與單獨Cd2+處理比較，光合色素含量和Pn隨著NaHS預處理濃度的增加呈現(xiàn)先增后降特點，50 μmol·L-1NaHS預處理下葉綠素含量、類胡蘿卜素含量和Pn顯著提高，分別提高了12.6%、15.2%和10.8%。說明一定濃度的外源H2S預處理能夠有效緩解Cd2+對小麥幼苗葉片光合色素合成的抑制和光合速率的降低，以50 μmol·L-1的NaHS預處理效果最好。

表1 不同濃度的NaHS對Cd2+脅迫下小麥幼苗的生長指標、葉片中光合色素含量和凈光合速率的影響Table 1 Effects of different concentration of NaHS on the growth indexes, photosynthetic pigment contents and net photosynthetic rate of wheat seedlings under Cd2+ stress

Control：空白對照組；Cd：Cd對照組；S1+Cd～S4+Cd：不同濃度的NaHS溶液(10、50、100和200 μmol·L-1)預處理再加50 μmol·L-1的CdCl2溶液處理組。同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Control is the group with no treatment; Cd is the group treated with 50 μmol·L-1cadmium chloride solution; S1+Cd～S4+Cd are the groups pretreated with different concentrations of NaHS solution (10, 50, 100, 200 μmol·L-1) and then treated with 50 μmol·L-1cadmium chloride solution. Different letters following the values in the same column indicate significant differences among the treatments at 0.05 level. The same below.

2.3 不同濃度NaHS對Cd2+脅迫下小麥體內(nèi)Cd含量和分布的影響

由表2可知，Cd對照小麥幼苗根部和地上部分的Cd積累量分別為2 596.73 μg·g-1DW和546.99 μg·g-1DW。與Cd2+對照相比，NaHS預處理顯著降低了老葉和地上部的Cd含量，以50 μmol·L-1的NaHS預處理降低幅度最大(21.6%、9.8%)，而莖稈、新葉中的Cd含量與Cd2+對照并無顯著差異；50和100 μmol·L-1的NaHS預處理顯著增加了小麥根系中的Cd含量，分別提高了24.5%和23.7%。NaHS預處理使小麥中Cd轉(zhuǎn)運系數(shù)顯著下降，以50 μmol·L-1NaHS預處理的效果最好，降低了27.5%，因此利用這一濃度進行下面的研究。

2.4 H2S對Cd2+脅迫下小麥幼苗葉片中MDA、H2O2和積累的影響

表2 H2S對Cd2+脅迫下小麥莖稈、新葉、老葉、地上部分、根系中Cd含量以及轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響Table 2 Effects of H2S on Cd concentration in the wheat stem, the new leaf, old leaves, shoot, root and Cd translocation factors under Cd2+ stress

表3 H2S對Cd2+脅迫下小麥葉片中的含量和小麥根中NPTs含量的影響Table 3 Effects of H2S on MDA, H2O2, contents of wheat leaves and NPTs contents both of wheat leaves and roots under Cd2+ stress

圖1 H2S對Cd2+脅迫下小麥葉片的DAB和NBT的染色結(jié)果

表4 不同處理對Cd2+脅迫下小麥幼苗生長的影響Table 4 Effects of different treatments on the growth of wheat seedlings under Cd2+ stress

2.5 H2S對Cd2+脅迫下小麥NPTs含量的影響

較空白對照，單獨NaHS預處理顯著增加了小麥葉片和根的NPTs含量，分別增加了23.9%和98.6%；Cd2+脅迫顯著增加了根部的NPTs含量；NaHS+Cd與單獨Cd2+處理相比，葉片和根的NPTs分別增加了12.5%和49.5%(表3)。

2.6 H2S抑制劑對Cd2+脅迫下小麥幼苗生長的影響

如表4所示，1 mmol·L-1的PAG處理對小麥幼苗被測生長指標均有顯著抑制作用。50 μmol·L-1的NaHS預處理后，株高和地上部干重顯著增加。在Cd2+存在下，NaHS+PAG預處理與PAG預處理相比，株高和地上部干重分別顯著提高了6.7%和29.2%；NaHS對小麥根長和地下部干重影響不顯著。說明外源NaHS預處理對Cd2+脅迫小麥的地上部生長有明顯正效應(yīng)。

2.7 H2S抑制劑對Cd2+脅迫下小麥幼苗光合特性的影響

Cd2+脅迫顯著降低了小麥葉片的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)，NaHS+Cd處理使Pn、Tr和Gs分別提高了16.3%、25.3%和29.6%，差異均顯著(表5)； PAG預處理使小麥幼苗上述指標顯著下降，而NaHS+PAG預處理使Pn和Ci顯著增加；在Cd2+脅迫下，NaHS+PAG預處理與PAG

預處理相比，Pn、Gs和Ci分別提高了18.5%、38.9%和24.9%，差異顯著。說明外源H2S對Cd2+脅迫下小麥幼苗的光合作用具有明顯上調(diào)作用。

2.8 H2S抑制劑對Cd2+脅迫下小麥幼苗葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

如表6所示，Cd2+脅迫使熒光參數(shù)值顯著降低，ABS/CSm、TRo/CSm、DIo/CSm和ETo/CSm分別降低了10.6%、10.7%、10.0%和14.8%；除了PAG處理組，各處理下的最大光化學效率Fv/Fm與對照相比無顯著差異；Cd2+處理使光系統(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)的性能指數(shù)PIABS顯著降低了18.3%；NaHS+Cd與Cd處理相比，ABS/CSm、TRo/CSm、DIo/CSm、ETo/CSm和PIABS分別提高了9.2%、9.0%、10.0%、13.0%和16.4%，差異顯著。在Cd2+脅迫下，NaHS+PAG與PAG處理相比，ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm和PIABS分別提高了7.4%、8.7%、17.6%和30.8%，差異顯著。表明H2S處理顯著改善了Cd脅迫下小麥葉片PS Ⅱ的光合性能指數(shù)與光能轉(zhuǎn)化效率。

表5 不同處理對Cd2+脅迫下小麥幼苗光合特性的影響Table 5 Effects of different treatments on photosynthetic characteristics of wheat seedlings under Cd2+ stress

表6 不同處理對Cd2+脅迫下小麥幼苗葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響Table 6 Effect of different treatments on chlorophyll fluorescence parameters of wheat leaves under Cd2+ stress

3 討 論

Cd是植物生長發(fā)育非必需營養(yǎng)元素之一，濃度過高對植物有很強的毒害作用，嚴重影響植物的生長發(fā)育和代謝[24-26]。在本研究中，Cd2+脅迫顯著抑制了小麥幼苗生長。外源低濃度的NaHS預處理能夠增加小麥幼苗的株高和生物量，說明外源低濃度的NaHS預處理可以提高小麥幼苗對Cd2+脅迫的耐受能力。Tian等[27]研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫抑制谷子葉片光合色素合成并加速光合色素降解，降低植物葉片的光合速率。在本研究中，Cd2+處理顯著降低小麥幼苗葉片中光合色素含量，而NaHS預處理后的光合色素含量與單獨Cd2+處理相比顯著增加，與前人的報道一致[28-29]；不同濃度的NaHS對小麥的凈光合速率影響與生物量、光合色素含量的變化有相似的趨勢。本研究中，Cd2+脅迫使小麥幼苗葉片中Pn、Gs和Ci顯著降低，小麥幼苗葉片Pn的降低多數(shù)由氣孔限制因素引起[30-31]；而外源施加H2S能夠顯著提高Pn、Gs和Tr，說明H2S能夠維持小麥葉片較高的光合能力，這可能與NaHS預處理下小麥幼苗葉片中光合色素含量顯著增加有關(guān)。

Liu等[32]報道，Cd脅迫對棉花葉片的最大光化學效率、量子產(chǎn)額、電子傳遞速率以及光化學淬滅的抑制與光合作用的減弱密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，Cd2+顯著降低了小麥葉片的ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm以及DIo/CSm，而NaHS預處理顯著提高了以上參數(shù)值，說明H2S提高了Cd2+脅迫下小麥幼苗葉片單位激發(fā)態(tài)面積吸收的能量、捕獲的用于還原QA的能量、還原態(tài)QA通過電子傳遞再氧化的活性以及以熱的形式耗散多余的能量，從而加快電子傳遞速率、保護光合機構(gòu)。

在正常情況下，F(xiàn)v/Fm保持在0.8左右，而逆境脅迫會對PS Ⅱ造成損傷或者發(fā)生光抑制，導致植物葉片F(xiàn)v/Fm顯著下降[33]，但Fv/Fm對Cd2+脅迫不敏感[34]。而PIABS表示PS Ⅱ以吸收光能為基礎(chǔ)的光合性能指標，反映原初光化學反應(yīng)的最大量子產(chǎn)額以及電子傳遞的量子產(chǎn)額，相比Fv/Fm對逆境更敏感[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn)，Cd2+脅迫處理能顯著降低小麥幼苗葉片的PIABS，而外源H2S顯著提高PIABS，說明H2S提高了PS Ⅱ反應(yīng)中心的氧化還原活性。

NaHS預處理顯著增加小麥根部對Cd的吸收積累，而地上部分Cd含量降低，推測H2S的作用是將大量的Cd固定在根中，減少向地上的轉(zhuǎn)運，從而顯著降低轉(zhuǎn)運效率。類似的結(jié)果還出現(xiàn)在Hg2+脅迫處理的水稻幼苗中，Chen等[38]發(fā)現(xiàn)NaHS預處理增加水稻幼苗根中Hg含量，而顯著降低地上部分的Hg含量。并且本研究首次發(fā)現(xiàn)NaHS預處理使小麥老葉中Cd含量顯著降低、使新葉中Cd含量變化不顯著。原因可能與NaHS和Cd2+處理時間有關(guān)，也可能是H2S會導致Cd在地上各部位的分配和積累產(chǎn)生差異。

植物抵抗重金屬毒害的機制有多種，其中一種便是胞內(nèi)含硫化合物與重金屬形成毒性較低的絡(luò)合物，包括非蛋白巰基化合物(NPTs)和蛋白巰基化合物，其中NPTs又包括半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)和植物螯合肽(PCs)[39]。H2S在植物體內(nèi)能夠快速氧化成過硫化物、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫酸鹽等，從而保持較低的H2S濃度，而那些氧化產(chǎn)物通過各種催化途徑合成GSH[40]，GSH是NPTs的主要組成部分，含有一個活潑的巰基基團，易被氧化，對于清除ROS、與Cd2+形成絡(luò)合物、促進PCs合成等具有重要作用[41]。本研究發(fā)現(xiàn)，H2S可促進根部NPTs的合成來固定根中的Cd2+，減少其向地上部分的轉(zhuǎn)運。

綜上所述，外源H2S通過增加小麥葉片和根中NPTs的含量，絡(luò)合過量的Cd2+，減少葉片中的ROS積累，增加葉綠素含量，保護光合電子傳遞系統(tǒng)，維持較高的光合能力，促進小麥幼苗生長，提高小麥幼苗對Cd2+脅迫的耐性。