肖 磊，楊 苑，李瑞航，謝利萍，邵景俠，郭藹光,2，徐 虹,2

(1. 西北農林科技大學生命學院，陜西楊凌 712100； 2.旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

本研究用二甲基聯(lián)苯胺(DAB)組織染色法測定返白系和矮變1號在4 ℃持續(xù)低溫條件及25 ℃恢復培養(yǎng)下葉片H2O2的含量；同時測定低溫處理下返白系和矮變1號幼苗葉片的葉綠素熒光參數(shù)，用qRT-PCR分析主要光合電子傳遞體基因以及清除質體活性氧相關酶類基因的表達量；分析返白系和矮變1號在低溫處理下葉片H2O2的含量是否存在差異，并初步分析導致差異的生理與分子機制，以期為深入探究ROS與返白系葉色白化的相關性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

供試材料為冬小麥品種矮變1號和返白系，種子獲贈于陜西省西安市農科所李丕皋研究員，由實驗室長期保存。挑選整齊一致的小麥種子，在室溫下用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，長到一葉一心期時移至4 ℃低溫人工氣候箱中，培養(yǎng)條件：光暗周期16/8 h，有效光量子密度250 μmol·m-2·s-1，相對濕度70%，持續(xù)低溫培養(yǎng)約90 d至返白系葉片全白，之后移至25 ℃人工氣候箱培養(yǎng)10 d待葉片復綠。

1.2 小麥葉片中H2O2含量的檢測

選取4 ℃低溫處理0、5、10、20、30和90 d，以及25 ℃復綠培養(yǎng)2、5和10 d后的小麥倒一展開葉，將去除葉尖后剩余的長約2.5 cm、寬約1 cm的葉片放入DAB染色液(0.1% 二甲基聯(lián)苯胺，0.1% Tween-20，用HCl調至pH5.6)中，避光染色24 h，之后將葉片放入脫色液(10%冰醋酸，10%丙三醇，用無水乙醇配制)中，加熱煮沸10 min脫色，4 ℃放置過夜后在體式顯微鏡下觀察拍照。

1.3 葉綠素熒光參數(shù)的測定

選取小麥幼苗的倒一展開葉進行測量。將小麥葉片平放在潤濕的濾紙上避光30 min后，立即放進葉綠素熒光成像儀中進行測量，按照軟件操作指南進行相關參數(shù)設定：Act1=20，Super=20，Shutter=20，Sensitivity = 40。選取葉片基部，用FluorCam Software 7.0軟件分析小麥葉片的原初光能轉化效率Fv/Fm、光化學淬滅系數(shù)qP的變化，每組處理測定3～5株小麥。

1.4 相關基因表達量的qRT-PCR檢測

根據本實驗室前期基因芯片檢測數(shù)據，結合葉綠體基因表達譜，篩選出返白系與矮變1號中與光合電子傳遞、活性氧清除相關且表達有差異的基因。在GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)和GrainGenes(https://wheat.pw.usda.gov/GG3/)中比對這些基因，確定序列保守區(qū)域，用Primer Premier 5.0軟件設計qRT-PCR引物(表1)。

表1 實時定量PCR引物Table 1 Primers for qRT-PCR

以各組處理的小麥幼苗心葉為材料，Trizol法提取心葉總RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本)說明書將總RNA反轉錄成cDNA。用ddH2O稀釋cDNA樣品至200 ng·μL-1左右，置-80 ℃?zhèn)溆?。使用PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa，日本)，在公司CFX-96型熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)上以TaARF(ADP-ribosylation factor)基因為內參基因，檢測基因的表達量變化。每個反應設置3個生物學重復，根據Ct值，利用公式2-△△Ct計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 低溫處理與升溫過程中返白系和矮變1號小麥葉片H2O2含量的動態(tài)變化

二氨基聯(lián)苯胺(DAB)滲透到植物組織中后可與細胞中的H2O2迅速反應，生成紅棕色聯(lián)苯胺腙沉淀，紅棕色程度深淺可以顯示細胞中H2O2的含量。用DAB染色法，檢測低溫持續(xù)處理90 d的過程中，及升溫復綠10 d過程中返白系葉片H2O2含量的動態(tài)變化，用矮變1號作為對照，結果如圖1、圖2所示。

圖1顯示，低溫處理前，返白系與矮變1號幼苗葉片H2O2含量基本一致。4 ℃低溫處理后，短期內(5和15 d)，矮變1號葉片H2O2含量無明顯變化，長期(30和90 d)低溫處理后矮變1號葉片的H2O2含量略有增加。與矮變1號相比，返白系葉片在低溫處理5 d時顏色就有較明顯加深，隨著低溫處理時間的延長，H2O2含量持續(xù)增加，在低溫處理90 d葉片全白時，葉片已呈明顯的紅棕色，H2O2含量達到最高值。表明低溫脅迫下返白系葉片中H2O2的含量明顯高于矮變1號，持續(xù)低溫引起了返白系葉片中H2O2的大量累積。

將低溫處理90 d的小麥幼苗移至25 ℃培養(yǎng)，可使白化的返白系葉片在短時間內復綠。由圖2看出，隨著25 ℃培養(yǎng)時間的延長，小麥葉片的染色逐漸變淺，25 ℃培養(yǎng)下5 d的返白系葉片著色與低溫處理5 d接近， 25 ℃培養(yǎng)10 d后葉片著色與低溫處理前基本一致。說明葉片中H2O2的含量隨著溫度的上升迅速下降，直至恢復到低溫處理前的水平，外界溫度條件調控了返白系葉片中H2O2的含量。

2.2 低溫處理下返白系和矮變1號小麥葉綠素熒光參數(shù)的變化

本研究采用了Fv/Fm和qP兩個葉綠素熒光參數(shù)來反映返白系在低溫條件下葉綠體光合電子傳遞能力。Fv/Fm是最大光化學量子產量，反映PSⅡ反應中心內有效光化學量子產量，即原初光能轉化效率。逆境脅迫下Fv/Fm明顯下降，是植物抗冷性的主要敏感指標。qP是光化學淬滅系數(shù)，表示由光合作用引起的熒光淬滅，反映了PSⅡ的天線色素分子將其所吸收的光能用于光化學電子傳遞的份額，也可反映PSⅡ原初電子受體QA的還原狀態(tài)。Fv/Fm和qP值的降低會引起質體ROS的累積。

從圖3可以看出，當?shù)蜏靥幚?0 d時，返白系表現(xiàn)出自葉片基部的黃化，對應區(qū)域的Fv/Fm和qP值低于矮變1號。當?shù)蜏靥幚?0 d時，返白系的葉片表現(xiàn)為全白，此時的Fv/Fm和qP也幾乎檢測不到。由此可知，低溫脅迫下，返白系葉片的光合電子傳遞效率和光合活性低于矮變1號。

A:矮變1號；F:返白系。下圖同。

圖2 室溫(25 ℃)復綠過程中小麥葉片H2O2含量的變化

2.3 低溫處理下返白系和矮變1號小麥中與質體H2O2累積相關基因的表達模式

對4個光合電子傳遞體亞基基因ndhB、ndhK、petD和petN，以及4個質體H2O2清除相關基因APX4、tAPX、sAPX和HO1進行實時定量PCR驗證，結果如圖4和圖5所示。

ndhB和ndhK是NDH復合體的亞基基因，petD和petN是Cytb6f復合體亞基基因，這4個基因都是由葉綠體編碼。由圖4看出，這4個基因對低溫響應很敏感，短時間低溫就可誘導4個基因的表達上調，ndhB在低溫2 d表達量達到最大值，其他3個基因的表達量分別在低溫10 d和20 d 達到峰值，之后則持續(xù)下調。溫度回升后，基因表達量又逐漸上調。低溫條件下，返白系中4個基因的相對表達量幾乎都顯著低于矮變1號，在低溫處理30 d和90 d葉片全白時，返白系和矮變1號中4個基因的表達水平差異非常明顯，這與圖2中返白系葉片的Fv/Fm和qP值明顯低于矮變1號相一致，光合電子傳遞體相關基因的表達水平低于矮變1號可能是返白系光合電子傳遞效率降低的部分原因。

圖5顯示，低溫條件下，4個基因在返白系中分別表現(xiàn)為先上調再下調(APX4、tAPX和HO1) 或上-下-上的變化模式(sAPX)。矮變1號與返白系基本一致，但APX4基因在持續(xù)低溫90 d時上調表達。說明這4個基因可以對低溫做出積極的響應，但每個基因對低溫的敏感程度和響應的模式不同。

Fv/Fm:最大光化學量子產量; qP:光化學淬滅系數(shù)。

比較兩種材料基因的表達量后看出，低溫處理前，在兩個材料間除sAPX基因差異不顯著外，其余3個基因均表現(xiàn)為返白系中的表達量顯著高于矮變1號。返白系中的APX4基因在低溫處理5 d、HO1基因在低溫處理20 d后，相對表達量就一直顯著低于矮變1號；至低溫90 d時，除sAPX外的其他3個基因均是返白系中的表達量顯著低于矮變1號。當溫度升高至25 ℃后，返白系中除sAPX外的其他3個基因表達量均表現(xiàn)為上調，至25 ℃處理10 d時，4個基因在返白系中的表達量又都略微或者顯著高于矮變1號。這些結果表明，相對于矮變1號，低溫抑制了返白系中APX4與HO1的表達，返白系中APX4與HO1的低水平表達減弱了清除質體中過量H2O2的能力，這可能是長期低溫條件引起返白系中H2O2累積的重要原因之一。

3 討 論

低溫會影響光合器官的結構和活性，影響光合電子傳遞和光合磷酸化過程[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理下，相較于矮變1號，返白系葉片會累積大量的H2O2；通過測定低溫處理下返白系和矮變1號葉片中表征光合電子傳遞效率的葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm、qP，發(fā)現(xiàn)隨著低溫處理時間的延長，返白系葉片中Fv/Fm、qP值明顯降低，揭示出低溫脅迫下返白系葉片的光合電子傳遞受阻，電子傳遞鏈效率降低，可能會發(fā)生嚴重的電子滲漏，并通過Mehler反應和SOD催化生成大量的H2O2。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理下，返白系光合電子傳遞鏈中NDH復合體的亞基基因ndhB、ndhK以及Cytb6f復合體亞基基因petD和petN的表達量都顯著低于矮變1號。NDH復合體和Cytb6f復合體是葉綠體中光合電子傳遞鏈中必不可少的組分和反應場所[22]，返白系中ndhB、ndhK、petD和petN較低的表達水平可能是低溫處理下返白系中光合電子傳遞的效率明顯低于矮變1號的重要原因，導致電子由PS中心流向NADP的途徑受阻，產生電子泄露，并最終生成H2O2。

A：矮變1號；F：返白系。*和**分別表示在相同處理條件下返白系與矮變1號之間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。下圖同。

細胞中活性氧的濃度是由產生和清除兩種途徑控制的[10]。本研究對低溫處理下返白系和矮變1號中質體H2O2清除相關基因APX4、tAPX、sAPX和HO1的qRT-PCR結果表明，在低溫處理下，返白系中APX4和HO1的表達水平顯著低于矮變1號。APX4和HO1在清除質體過量的H2O2上發(fā)揮著重要作用，其中APX是一種亞鐵血紅素蛋白，它以抗壞血酸為電子供體將H2O2分解為水，APX4可以與血紅素結合, 具有抗氧化活性，能夠清除葉綠體中的ROS[12]。過表達chlAPX和HO可以增強植物的抗氧化脅迫和抗逆性[14,23]。低溫處理下返白系質體中APX4和HO1相對較低的表達量意味著低溫處理下返白系質體(特別是基粒類囊體)中大量積累的H2O2不能得到有效清除，使得返白系質體中H2O2維持在較高的水平。一方面，低溫處理下返白系中由于光合電子傳遞受阻，電子泄露，最終反應生成大量H2O2；另一方面，低溫處理下，返白系中清除質體H2O2的關鍵酶APX4和HO1的表達水平較低，質體H2O2清除能力減弱，共同作用下導致了低溫處理下返白系葉片中H2O2的大量累積。低溫處理下返白系葉片累積的H2O2可能與低溫誘導白化現(xiàn)象存在相關性，其對葉色白化的影響還有待于深入研究。

圖5 質體H2O2清除相關基因表達分析