袁 麗，孫楚楚，黨慶玲，高瑞昌*

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

花色苷是一大類(lèi)水溶性植物色素，擁有抗氧化、抗癌、改善肝功能、抗心血管疾病、抗炎、保護(hù)視力等多種生理作用[1-4]。盡管花色苷已被報(bào)道具有多種生物活性，但其生物活性非常低[5]?；ㄉ帐且淮箢?lèi)多酚類(lèi)化合物的總稱(chēng)，具有很活躍的反應(yīng)特性，穩(wěn)定性差，一旦與原來(lái)周?chē)h(huán)境即植物細(xì)胞分離，很快就會(huì)降解[6-7]。在眾多影響因素中，pH值對(duì)花色苷的影響最為顯著。花色苷的穩(wěn)定性會(huì)隨著pH值的升高而降低，當(dāng)pH≤2時(shí)，花色苷具有較高的穩(wěn)定性，當(dāng)pH≥7時(shí)，穩(wěn)定性非常低[8]。但是，人類(lèi)小腸腸腔內(nèi)pH值在7.4左右，花色苷會(huì)迅速分解，生物利用度大大降低。因此研究者需要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)能使花色苷穩(wěn)定的酸性環(huán)境，使其能到達(dá)小腸吸收部位。

將花色苷進(jìn)行包埋是提高花色苷穩(wěn)定性和生物利用度的重要途徑之一。目前對(duì)花色苷的包埋途徑主要有3 種：一是利用脂質(zhì)體進(jìn)行包埋，但脂質(zhì)體仍舊存在一些問(wèn)題，如包封率較低、無(wú)法控制釋放藥物的速率和時(shí)間、穩(wěn)定性易受環(huán)境影響等[9-10]；二是通過(guò)微囊包埋，如利用明膠、海藻酸鈉等各種生物大分子進(jìn)行包埋，但微囊體系粒徑較大、緩釋效果不理想，不利于花色苷在體內(nèi)的靶向釋放[11-13]；三是通過(guò)復(fù)乳體系對(duì)花色苷進(jìn)行包埋。W/O/W型復(fù)乳是指將內(nèi)水相分散在油相中，再將這個(gè)包有水滴的油相分散在水中，以此形成一個(gè)兩面三相的結(jié)構(gòu)[14-15]。復(fù)乳特殊的結(jié)構(gòu)賦予其優(yōu)良的性能：一是可創(chuàng)造一個(gè)物質(zhì)所需要的內(nèi)水相微環(huán)境，同時(shí)隔絕氧、光、酶等，提高內(nèi)水相物質(zhì)的穩(wěn)定性；二是具有一定的緩釋靶向作用，可將內(nèi)水相物質(zhì)靶向釋放；三是可以減少某些食品配料用量，如冰激凌等中脂肪的用量[16]。但是復(fù)乳本身是一個(gè)熱力學(xué)不穩(wěn)定體系[17]，易受到制備方法、乳化劑、各相比例、滲透壓等因素的影響。

目前有少量報(bào)道認(rèn)為復(fù)乳體系可促進(jìn)花色苷在小腸部位的釋放[18]，但是所制備的花色苷包封率較低、穩(wěn)定性差。本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，內(nèi)水相以檸檬酸創(chuàng)造pH 2的酸性環(huán)境，提高花色苷的穩(wěn)定性，以聚甘油蓖麻醇酯（polyglyceryl-3 polyricinoleate，PGPR）為油相乳化劑、Span-80/Tween-80復(fù)配為親水性乳化劑、黃原膠為穩(wěn)定劑，用兩步法制備復(fù)乳，并對(duì)其制備工藝、乳化劑配方進(jìn)行優(yōu)化，再用制備的復(fù)乳包埋矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C-3-G），以期制備高穩(wěn)定性的C-3-G納米包埋體系，促進(jìn)花色苷類(lèi)物質(zhì)的廣泛應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C-3-G（純度≥90%） 上海精方科學(xué)儀器有限公司；黃原膠 上海源葉生物科技有限公司；葵花子油上海福臨門(mén)食品有限公司；PGPR 上海佑創(chuàng)實(shí)業(yè)有限公司；一水合檸檬酸、氯化鈉、Span-80、Tween-80、無(wú)水乙醇、丙酮（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T25分散儀 德國(guó)IKA公司；萬(wàn)分之一天平、電子稱(chēng)德國(guó)賽多利斯公司；85-1磁力攪拌器 金壇市醫(yī)療儀器廠；TGL-16gR飛鴿牌系列離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；UV1600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；DISCOVERY HR-1流變儀 美國(guó)TA儀器公司；90PLUS高靈敏度Zeta電位及粒度分析儀 美國(guó)布魯克海文公司；FE 20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；光學(xué)顯微鏡 上海光學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 制備工藝對(duì)復(fù)乳性質(zhì)的影響

在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用兩步法制備復(fù)乳。先將內(nèi)水相與含有乳化劑的油相高速剪切均質(zhì)，制備初乳。再將初乳與含有乳化劑的外水相剪切均質(zhì)，制備復(fù)乳。復(fù)乳制備的初始工藝和配方為：初乳攪拌速率7 000 r/min、復(fù)乳攪拌速率3 500 r/min、內(nèi)水相為pH 2的檸檬酸溶液、初乳水-油質(zhì)量比3∶7、油相為葵花籽油、油相乳化劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% PGPR、外水相為蒸餾水、外水相親水乳化劑為Span-80/Tween-80復(fù)配、親水親油平衡（hydrophile lipophilic balance，HLB）值為10、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、初乳與外水相質(zhì)量比3∶7。

1.3.1.1 初乳攪拌速率對(duì)復(fù)乳性質(zhì)的影響

控制其他因素如初始工藝和配方不變，設(shè)置初乳攪拌速率為7 000、11 000、15 500、20 000 r/min，考察初乳攪拌速率對(duì)初乳離心保留率、初乳流變性、復(fù)乳離心保留率、復(fù)乳流變性和復(fù)乳顯微結(jié)構(gòu)等性質(zhì)的影響，并選出最優(yōu)初乳攪拌速率。

1.3.1.2 復(fù)乳攪拌速率對(duì)復(fù)乳性質(zhì)的影響

控制其他因素如初始工藝和配方不變，復(fù)乳攪拌速率為3 500、7 000、11 000 r/min，初乳攪拌速率為15 500 r/min，考察復(fù)乳攪拌速率對(duì)復(fù)乳離心保留率、復(fù)乳流變性和復(fù)乳顯微結(jié)構(gòu)等性質(zhì)的影響，并選出最優(yōu)復(fù)乳攪拌速率。

1.3.2 乳化劑對(duì)復(fù)乳性質(zhì)的影響

1.3.2.1 油相PGPR添加量對(duì)復(fù)乳性質(zhì)的影響

油相乳化劑P G P R添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以下同）為6%、8%、10%、12%、14%，初乳攪拌速率15 500 r/min、復(fù)乳攪拌速率7 000 r/min、初乳水-油質(zhì)量比3∶7、內(nèi)水相NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、內(nèi)水相黃原膠添加量0.2%，控制其他因素如初始工藝和配方不變，考察PGPR添加量對(duì)初乳離心保留率、初乳流變性、復(fù)乳離心保留率、復(fù)乳流變性和復(fù)乳顯微結(jié)構(gòu)等性質(zhì)的影響，并選出最優(yōu)PGPR添加量。

1.3.2.2 外水相乳化劑HLB值對(duì)復(fù)乳性質(zhì)的影響

外水相乳化劑HLB值為7.5、8、8.5、9.5、10、12、14，初乳攪拌速率15 500 r/min、復(fù)乳攪拌速率7 000 r/min、初乳水-油質(zhì)量比3∶7、內(nèi)水相NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、內(nèi)水相黃原膠添加量0.2%、PGPR添加量14%，控制其他因素如初始工藝和配方不變，考察外水相乳化劑HLB值對(duì)復(fù)乳離心保留率、復(fù)乳流變性和復(fù)乳顯微結(jié)構(gòu)等性質(zhì)的影響，并選出最優(yōu)HLB值。

1.3.2.3 外水相乳化劑添加量對(duì)復(fù)乳性質(zhì)的影響

外水相乳化劑添加量為4%、7%、10%、13%、16%，初乳攪拌速率15 500 r/min、復(fù)乳攪拌速率7 000 r/min、初乳水-油質(zhì)量比3∶7、內(nèi)水相NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、內(nèi)水相黃原膠添加量0.2%、PGPR添加量14%、外水相乳化劑HLB值9.5，控制其他因素如初始工藝和配方不變，考察外水相乳化劑添加量對(duì)復(fù)乳離心保留率、復(fù)乳流變性和復(fù)乳顯微結(jié)構(gòu)等性質(zhì)的影響，并選出外水相乳化劑最優(yōu)添加量。

1.3.3 乳化劑均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，初乳攪拌速率15 500 r/min、復(fù)乳攪拌速率7 000 r/min、初乳水-油質(zhì)量比3∶7、內(nèi)水相NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、內(nèi)水相黃原膠添加量0.2%、PGPR添加量14%、外水相乳化劑HLB值9.5、外水相乳化劑添加量13%、外水相黃原膠添加量2%，初乳與外水相質(zhì)量比5∶5，采用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)組合，對(duì)油相乳化劑和外水相乳化劑對(duì)復(fù)乳穩(wěn)定性綜合影響進(jìn)行研究，按均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)U7（74）對(duì)油相乳化劑PGPR添加量、外水相乳化劑（Span-80/Tween-80）HLB值、外水相乳化劑（Span-80/Tween-80）添加量進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4 復(fù)乳離心保留率

單因素試驗(yàn)時(shí)，將制備的復(fù)乳1 500 r/min離心15 min，測(cè)定乳化層的體積。均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)，將復(fù)乳3 000 r/min離心15 min，測(cè)定乳化層的體積。離心保留率根據(jù)公式（1）計(jì)算：

1.3.5 流變性測(cè)定

選擇40 mm平行夾具，設(shè)置間距為1 000 μm，選擇Flow-Sweep模式，剪切速率范圍為1～100 s-1，剪切時(shí)間為60 s，溫度為25 ℃，將樣品置于樣品臺(tái)上，修邊后進(jìn)行測(cè)量。

1.3.6 顯微結(jié)構(gòu)觀察

單因素試驗(yàn)時(shí)取少量制備好的復(fù)乳于載玻片上，蓋上蓋玻片，調(diào)節(jié)顯微鏡觀察復(fù)乳結(jié)構(gòu)，并用顯微鏡自帶拍攝系統(tǒng)拍照。

C-3-G包埋實(shí)驗(yàn)時(shí)取少量復(fù)乳稀釋20 倍再于載玻片上，蓋上蓋玻片，調(diào)節(jié)顯微鏡觀察復(fù)乳結(jié)構(gòu)，并用顯微鏡自帶拍攝系統(tǒng)拍照。

1.3.7 C-3-G含量測(cè)定

取一定量不含C-3-G的復(fù)乳，用蒸餾水稀釋2 倍，500 r/min離心30 min，棄去上層，取下層水相，將下層水相按質(zhì)量比1∶1與有機(jī)試劑混合破乳，振蕩5 min（其中有機(jī)試劑為無(wú)水乙醇與丙酮按體積比1∶1配制）。破乳后4 ℃、9 000 r/min離心30 min，取上層，按質(zhì)量比1∶1用pH 2檸檬酸溶液酸化制得對(duì)照組溶劑。準(zhǔn)確稱(chēng)取1 mg C-3-G溶于溶劑，并定容至10 mL，分別取不同質(zhì)量的上述C-3-G溶液稀釋?zhuān)玫劫|(zhì)量濃度為50、25、10、5、1 mg/L和0.5 mg/L的C-3-G溶液，在波長(zhǎng)533 nm處測(cè)定吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得到回歸方程：y=0.023 1x+0.049 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 3，表明C-3-G質(zhì)量濃度和吸光度在0.5～100 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.3.8 包封率的計(jì)算

取一定量復(fù)乳，用蒸餾水稀釋?zhuān)?00 r/min離心30 min，棄去上層，取下層水相，將下層水相按質(zhì)量比1∶1與有機(jī)試劑混合破乳，振蕩5 min（其中有機(jī)試劑為無(wú)水乙醇與丙酮按體積比1∶1配制）。破乳后4 ℃、9 000 r/min離心30 min，取上層，按質(zhì)量比1∶1用pH 2檸檬酸溶液酸化，于533 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算C-3-G含量。包封率根據(jù)公式（2）、（3）進(jìn)行計(jì)算：

外水相泄露的C-3-G的量/μg=C測(cè)量值×n1×n2×m1（3）

式中：n1為C-3-G溶液在黃烊鹽化時(shí)被稀釋的倍數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中為2；n2為破乳時(shí)C-3-G溶液被稀釋的倍數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中為2；C測(cè)量值為C-3-G含量/（μg/g）；m1為復(fù)乳稀釋后外水相加蒸餾水的質(zhì)量/g。

1.3.9 電位、粒徑的測(cè)定

制備樣品后，用蒸餾水稀釋1 000 倍后立即測(cè)定粒徑和電位，參數(shù)設(shè)置為：He-Ne光源，功率為5 mW，波長(zhǎng)為640 nm，散射角90°，測(cè)試時(shí)間3 min，測(cè)定溫度25 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

利用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有實(shí)驗(yàn)均最少為3 次重復(fù)，計(jì)算結(jié)果均以 ±s表示。圖像采用顯微鏡配套的ScopeImage 9.0（H5D）軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備方法對(duì)復(fù)乳性質(zhì)的影響

2.1.1 初乳攪拌速率對(duì)乳液性質(zhì)的影響

表1 初乳攪拌速率對(duì)乳液離心保留率的影響Table 1 Effect of stirring rate for fi rst emulsification on retention rate of emulsions after centrifugation

圖1 初乳攪拌速率對(duì)初乳流變性的影響Fig. 1 Effect of stirring rate for fi rst emulsification on emulsion viscosity

圖2 初乳攪拌速率對(duì)復(fù)乳流變性的影響Fig. 2 Effect of stirring rate for second emulsification on emulsion viscosity

圖3 初乳攪拌速率對(duì)復(fù)乳顯微結(jié)構(gòu)的影響（10×40）Fig. 3 Effect of stirring rate for fi rst emulsification on microstructure of multiple emulsions (10 × 40)

初乳攪拌速率會(huì)影響內(nèi)水相的粒徑從而對(duì)復(fù)乳性質(zhì)產(chǎn)生影響。如表1所示，隨初乳攪拌速率的增加初乳的離心保留率增加，當(dāng)初乳攪拌速率達(dá)到15 500 r/min時(shí)離心保留率最大，達(dá)到99.04%，當(dāng)初乳攪拌速率繼續(xù)增加，初乳離心保留率不再增加。由圖1～3可看出，隨初乳攪拌速率增加，初乳粒徑減小，黏度增加。乳化過(guò)程的本質(zhì)是剪切力所產(chǎn)生的黏力克服拉普拉斯壓力梯度，使分散相發(fā)生形變[19]。拉普拉斯壓力梯度與粒徑有關(guān)，粒徑越小，拉普拉斯壓力梯度越大，則分散速率增加，產(chǎn)生的黏性力增加，所能克服的拉普拉斯壓力梯度越大，粒徑越小。隨初乳攪拌速率的增加，復(fù)乳離心保留率出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在初乳攪拌速率為15 500 r/min時(shí)達(dá)到最高，為57.82%，可見(jiàn)此時(shí)初乳的攪拌速率制備復(fù)乳最為合適。Yang Yang等[20]研究也表明，初乳攪拌速率與內(nèi)水相液滴分散程度密切相關(guān)，直接影響初乳和復(fù)乳的性質(zhì)。初乳攪拌速率降低，則初乳粒徑較大，黏度減小，制備復(fù)乳時(shí)容易被破壞，而初乳攪拌速率增加，初乳黏度則過(guò)大不適于制備復(fù)乳時(shí)的分散。

2.1.2 復(fù)乳攪拌速率對(duì)乳液性質(zhì)的影響

表2 復(fù)乳攪拌速率對(duì)乳液離心保留率的影響Table 2 Effect of stirring rate for second emulsification on the retention of emulsions

圖4 復(fù)乳攪拌速率對(duì)復(fù)乳流變性的影響Fig. 4 Effect of stirring rate for second emulsification on viscosity of multiple emulsions

圖5 復(fù)乳攪拌速率對(duì)復(fù)乳顯微結(jié)構(gòu)的影響（10×40）Fig. 5 Effect of stirring rate for second emulsification on microstructure of multiple emulsions (10 × 40)

如圖5所示，攪拌速率越大油滴越小。Schuch等[21]研究表明油滴的大小會(huì)影響復(fù)乳的包封率，油滴越大包封率越高。同時(shí)復(fù)乳攪拌速率也會(huì)影響乳液的流變性（圖4），隨剪切速率的增加，復(fù)乳黏度呈先平穩(wěn)后下降。根據(jù)球形顆粒懸浮剪切黏度半經(jīng)驗(yàn)方程，復(fù)乳的黏度會(huì)隨著體系中內(nèi)水相和油相所占比例的增加而增加[22]。當(dāng)復(fù)乳攪拌速率小于7 000 r/min時(shí)，初乳結(jié)構(gòu)未遭到破壞，黏度變化不大，當(dāng)復(fù)乳攪拌速率為11 000 r/min時(shí)，可能是因?yàn)椴糠殖跞楸黄茐?，?nèi)水相合并到外水相中，使體系中內(nèi)水相和油相所占比例減小，導(dǎo)致黏度降低。而復(fù)乳的粒徑和黏度又會(huì)影響復(fù)乳的穩(wěn)定性，如表2所示，隨復(fù)乳攪拌速率增加，復(fù)乳的離心穩(wěn)定性先上升后趨于平穩(wěn)。由此可見(jiàn)，復(fù)乳攪拌速率可能是通過(guò)影響油滴大小影響體系的穩(wěn)定性。但這并不意味著制備復(fù)乳時(shí)攪拌速率越高越好，過(guò)高的攪拌速率會(huì)破壞初乳的結(jié)構(gòu)，最終形成水包油型單層乳液。從圖5可以看出，復(fù)乳攪拌速率達(dá)到11 000 r/min時(shí)，部分顆粒已經(jīng)失去內(nèi)水相，說(shuō)明復(fù)乳攪拌速率過(guò)大已經(jīng)破壞了初乳的結(jié)構(gòu)，Vilanova等[23]研究結(jié)果也表明復(fù)乳攪拌速率應(yīng)低于初乳，可防止對(duì)初乳結(jié)構(gòu)的破壞。綜上，本實(shí)驗(yàn)條件下復(fù)乳攪拌速率為7 000 r/min最合適。

2.2 乳化劑對(duì)復(fù)乳性質(zhì)的影響

2.2.1 PGPR添加量對(duì)乳液性質(zhì)的影響

表3 PGPR添加量對(duì)乳液離心保留率的影響Table 3 Effect of PGPR content on retention rate of emulsions after centrifugation

圖6 PGPR添加量對(duì)初乳流變性的影響Fig. 6 Effect of PGPR content on viscosity of primary emulsions

圖7 PGPR添加量對(duì)復(fù)乳流變性的影響Fig. 7 Effect of PGPR content viscosity of multiple emulsions

圖8 PGPR添加量對(duì)復(fù)乳顯微結(jié)構(gòu)的影響（10×40）Fig. 8 Effect of PGPR content on microstructure of multiple emulsions (10 × 40)

PGPR是一種常用的親脂性乳化劑，其含量對(duì)復(fù)乳性質(zhì)有顯著影響，含量過(guò)低時(shí)界面膜極性較大，不能形成復(fù)乳，含量過(guò)高導(dǎo)致初乳黏度過(guò)高，不利于復(fù)乳的制備[24]。如表3所示，在實(shí)驗(yàn)PGPR添加量范圍內(nèi)，PGPR添加量雖然對(duì)初乳的離心保留率影響不大，都保持在99%，但隨其添加量的增加，復(fù)乳離心保留率出現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)，在14%時(shí)已達(dá)到最高（76.17%），因此14%已經(jīng)滿(mǎn)足形成復(fù)乳的條件。

由圖6可知，PGPR添加量對(duì)初乳黏度影響顯著，初乳黏度隨著PGPR添加量的增加而增加，因?yàn)镻GPR本身黏度較高，增加整個(gè)油相的黏度。同樣根據(jù)球形顆粒懸浮剪切黏度半經(jīng)驗(yàn)方程，體系的黏度會(huì)隨連續(xù)相黏度的增加而增加[22]。油相黏度增加，即初乳中連續(xù)相黏度增加，所以初乳黏度增加。但PGPR添加量對(duì)復(fù)乳黏度影響不大（圖7）。

由圖8可知，PGPR添加量會(huì)對(duì)內(nèi)水相粒徑和復(fù)乳粒徑產(chǎn)生影響。內(nèi)水相粒徑隨PGPR添加量的增減而減小，因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)PGPR添加量的增加，可降低內(nèi)水相的相互聚集，從而使內(nèi)水相粒徑減小，提高復(fù)乳穩(wěn)定性[25]。復(fù)乳粒徑隨PGPR添加量增加呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)。PGPR添加量處于較低水平時(shí)，其添加量的增加降低界面極性，利于復(fù)乳的制備；當(dāng)PGPR添加量過(guò)高時(shí)會(huì)在脂層中形成膠束，使初乳的黏度增大，不利于復(fù)乳的制備[26]。

2.2.2 外水相乳化劑HLB值對(duì)乳液性質(zhì)的影響

表4 外水相乳化劑的HLB值對(duì)乳液離心保留率的影響Table 4 Effect of external water phase emulsifier HLB on retention rate of emulsions after centrifugation

圖9 外水相乳化劑的HLB值對(duì)復(fù)乳流變性的影響Fig. 9 Effect of external water phase emulsifier HLB on viscosity of multiple emulsions

圖10 外水相乳化劑HLB值對(duì)復(fù)乳顯微結(jié)構(gòu)的影響（10×40）Fig. 10 Effect of external water phase emulsifier HLB on microstructure of multiple emulsions (10 × 40)

HLB值是對(duì)乳化劑親油親水性質(zhì)的描述，值越低親油性越強(qiáng)，值越高親水性越強(qiáng)。復(fù)合乳化劑有更廣泛的HLB值域，所形成的界面膜更致密[27]，本實(shí)驗(yàn)選擇Span-80和Tween-80的復(fù)配作為親水性乳化劑。如表4所示，隨HLB值的增加，復(fù)乳離心保留率出現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，在9.5時(shí)達(dá)到最高，為74.67%，因?yàn)楫?dāng)HLB值過(guò)低時(shí)界面極性較大不能形成復(fù)乳，乳液大部分還是W/O型簡(jiǎn)單乳液；HLB值過(guò)高時(shí)，一方面形成的復(fù)乳顆粒較大，另一方面可能破壞復(fù)乳的結(jié)構(gòu)[28]。如圖9所示，隨著HLB值越高，復(fù)乳黏度減小，因?yàn)镠LB值升高，乳液整體親水性增加，流動(dòng)性增加。從圖10可以看出，當(dāng)HLB值低于8.5時(shí)，不能形成復(fù)乳，大部分乳液還是簡(jiǎn)單的W/O型，當(dāng)HLB值繼續(xù)增加，復(fù)乳粒徑呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，與Schmidts等[28]的研究結(jié)果一致，在9.5時(shí)，粒徑達(dá)到最低。當(dāng)HLB≥9.5時(shí)，離心保留率變化趨勢(shì)與粒徑變化趨勢(shì)一致。綜上，本實(shí)驗(yàn)外水相HLB值選為9.5。

2.2.3 外水相乳化劑添加量對(duì)乳液性質(zhì)的影響

表5 外水相乳化劑添加量對(duì)乳液離心保留率的影響Table 5 Effect of external water phase emulsifier contents on retention rate of emulsions after centrifugation

圖11 外水相乳化劑添加量對(duì)復(fù)乳流變性的影響Fig. 11 Effect of external water phase emulsifier contents on viscosity of multiple emulsions

圖12 外水相乳化劑添加量對(duì)復(fù)乳顯微結(jié)構(gòu)的影響（10×40）Fig. 12 Effect of external water phase emulsifier content on microstructure of multiple emulsions (10 × 40)

如表5所示，外水相乳化劑添加量對(duì)復(fù)乳的形成影響較大，隨外水相乳化劑增加，復(fù)乳離心保留率先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)，當(dāng)乳化劑含量增加到13%時(shí)，復(fù)乳離心保留率為（77.2±0.98）%，之后乳化劑添加量繼續(xù)增加，復(fù)乳離心保留率變化不大，乳化劑添加量在一定范圍內(nèi)增加可促進(jìn)乳液穩(wěn)定性。

如圖11所示，當(dāng)乳化劑添加量低于10%時(shí)，復(fù)乳的黏度隨外水相乳化劑添加量增加而降低，此時(shí)，界面膜較薄、彈性低、穩(wěn)定性差；當(dāng)乳化劑添加量高于10%時(shí)，形成的復(fù)乳界面膜較厚，彈性較高，穩(wěn)定性較高，而此時(shí)黏度變化不大，可能是10%已滿(mǎn)足復(fù)乳形成的最低劑量需要。

如圖12所示，當(dāng)其添加量較低形成的復(fù)乳直徑較大，有部分并沒(méi)有形成復(fù)乳，還是W/O型乳液。當(dāng)其添加量增加，形成復(fù)乳粒徑逐漸減小。乳化劑添加量增加，可形成界面膜的面積增加，而初乳總體積不變，引起復(fù)乳粒徑減小，顆粒數(shù)增加[29]，乳化劑添加量增加到13%時(shí)粒徑達(dá)到最低。若添加量繼續(xù)增加，多余的乳化劑會(huì)先在界面堆積，使復(fù)乳粒徑增大，當(dāng)含量高到一定程度后，會(huì)在外水相形成膠束，而膠束會(huì)吸引一部分乳化劑從界面膜上脫離，不利于乳液的穩(wěn)定[26]。

2.3 乳化劑配方的優(yōu)化結(jié)果

油相和外水相乳化劑的親油親水性和添加量對(duì)復(fù)乳產(chǎn)生重要的影響，它們之間的相互作用不可忽視，有研究表明，親水親油乳化劑HLB值之間比例即親水疏水加權(quán)值對(duì)復(fù)乳的穩(wěn)定性有顯著影響[30]，因此在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)油相乳化劑PGPR添加量、親水性乳化劑Span-80和Tween-80復(fù)配的HLB值和添加量進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以復(fù)乳離心保留率為響應(yīng)值，具體設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)U7（74）因素水平設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Uniform design in terms of coded and experimental levels with response

利用SPSS 16.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二項(xiàng)回歸分析，得方程擬合相關(guān)系數(shù)R值為1，決定系數(shù)R2值為1，調(diào)整值為0.98，認(rèn)為方程擬合度良好。對(duì)模型系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，PGPR添加量和親水性乳化劑添加量交互項(xiàng)（P=0.021＜0.05）、親水性乳化劑的HLB值和親水性乳化劑添加量交互項(xiàng)（P=0.043＜0.05）、親水性乳化劑HLB值的平方項(xiàng)（P=0.025＜0.05）影響顯著，以PGPR添加量為X1、親水性乳化劑的HLB值為X2、親水性乳化劑添加量為X3，得復(fù)乳離心保留率回歸方程為：Y=-5 084.13X1X3+68.084X2X3+4 147.448X12。

對(duì)方程進(jìn)行顯著性分析檢驗(yàn)，分析結(jié)果如表7所示，F(xiàn)值為11.254，P值為0.003，回歸模型顯著。根據(jù)方程求解得到最優(yōu)條件：PGPR添加量16%、外水相乳化劑HLB值10、外水相乳化劑添加量10%，復(fù)乳離心保留率為85.17%。根據(jù)所得優(yōu)化條件進(jìn)行優(yōu)化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，得復(fù)乳離心保留率為80.25%。

表7 方程顯著性檢驗(yàn)Table 7 Significance test

2.4 包埋C-3-G對(duì)復(fù)乳性質(zhì)的影響

2.4.1 C-3-G復(fù)乳的載藥量和包封率

表8 C-3-G復(fù)乳的載藥量和包封率Table 8 Drug-loading rate and encapsulation ef fi ciency of C-3-G multiple emulsion

C-3-G在pH 2的條件下是一種陽(yáng)離子型，包埋C-3-G可增加復(fù)乳內(nèi)水相的滲透壓。Neumann等[32]指出內(nèi)水相滲透壓隨著內(nèi)水相離子濃度的增加而增加，則內(nèi)水相滲透壓會(huì)隨內(nèi)水相C-3-G質(zhì)量濃度增加而增加。Leong等[31]指出內(nèi)水相滲透壓是外水相10 倍時(shí)復(fù)乳才能達(dá)到穩(wěn)定。從表8可以看出，當(dāng)內(nèi)水相中C-3-G質(zhì)量濃度高于1 000 mg/L時(shí)，隨質(zhì)量濃度的增加包封率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在載藥量為1 500 mg/L時(shí)，包封率達(dá)到最高，為（98.08±1.56）%。因?yàn)楫?dāng)C-3-G質(zhì)量濃度低于1 500 mg/L時(shí)滲透壓較低，容易導(dǎo)致內(nèi)水外滲，降低包封率；質(zhì)量濃度高于1 500 mg/L時(shí)，內(nèi)水相滲透壓過(guò)高，引起外水內(nèi)滲，最終使復(fù)乳粒破裂，降低包封率。當(dāng)質(zhì)量濃度低于1 000 mg/L時(shí)，內(nèi)水相滲透壓更低，更多的內(nèi)水相滲透到外水相中，可推測(cè)其包封率應(yīng)低于質(zhì)量濃度為1 000 mg/L時(shí)樣品的包封率，由于內(nèi)水相C-3-G添加量低，同時(shí)外水相C-3-G在檢測(cè)時(shí)又被不斷稀釋?zhuān)蕦?dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。綜上，C-3-G復(fù)乳最適的載藥量為1 500 mg/L。

2.4.2 包埋C-3-G對(duì)復(fù)乳特性的影響

表9 包埋C-3-G對(duì)復(fù)乳粒徑、電位、離心穩(wěn)定性的影響Table 9 Effect of C-3-G loading on particle size, potential and centrifugal stability of multiple emulsion

圖13 包埋C-3-G對(duì)復(fù)乳流變性的影響Fig. 13 Effect of C-3-G loading on viscosity of multiple emulsions

由表9可知，內(nèi)水相添加C-3-G后，對(duì)復(fù)乳電位影響不顯著（P＞0.05），對(duì)體系黏度影響也不明顯（圖13），但對(duì)復(fù)乳粒徑和離心保留率有顯著影響。粒徑從517.20 nm增加到688.99 nm，離心保留率從82.74%上升到93.05%?；ㄉ盏募尤胩岣吡藘?nèi)水相的滲透壓，阻止內(nèi)水相向外滲透，提高了粒徑和穩(wěn)定性[32]。

2.4.3 包埋C-3-G對(duì)復(fù)乳顯微結(jié)構(gòu)的影響

圖14 包埋C-3-G對(duì)復(fù)乳對(duì)復(fù)乳顯微結(jié)構(gòu)的影響（10×100）Fig. 14 Effect of C-3-G loading on microstructure of multiple emulsions (10 × 100)

如圖14所示，未包埋C-3-G復(fù)乳和包埋C-3-G復(fù)乳均呈完整的W/O/W型，表明內(nèi)水相包埋C-3-G并未對(duì)復(fù)乳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響。從圖14也可以看出，復(fù)乳粒徑顯著小于單因素試驗(yàn)時(shí)的粒徑，可能有兩方面原因，一是乳化劑進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化對(duì)復(fù)乳粒徑有影響，使粒徑降低；二是此處是將復(fù)乳稀釋20 倍后再觀察。

2.4.4 C-3-G復(fù)乳穩(wěn)定性的影響因素結(jié)果

圖15 C-3-G復(fù)乳穩(wěn)定性的影響因素Fig. 15 Factors affecting C-3-G multiple emulsion stability

如圖15所示，25 ℃時(shí)復(fù)乳離心保留率隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯降低，第2天25 ℃無(wú)光條件下已經(jīng)下降到67.03%，25 ℃有光條件下降到58.45%，第6天時(shí)，25 ℃條件下復(fù)乳已經(jīng)分層。而4 ℃下第6天離心保留率依然保持在70%以上的高水平，表明復(fù)乳對(duì)溫度有著較高的敏感性。Shakeel等[33]研究也表明室溫不利于復(fù)乳的穩(wěn)定性。有光條件下復(fù)乳離心保留率下降速率明顯高于無(wú)光條件下。25 ℃時(shí)第4天有光條件下離心保留率為51.39%，無(wú)光條件下為63.08%，差異顯著（P＜0.05）?？赡苁且?yàn)镃-3-G具有光敏感性，光照條件下易降解，產(chǎn)生醛類(lèi)和酚酸類(lèi)產(chǎn)物對(duì)復(fù)乳體系產(chǎn)生影響，影響體系穩(wěn)定。

圖16 C-3-G復(fù)乳不同保存條件下外觀形態(tài)隨時(shí)間的變化Fig. 16 Appearance changes of C-3-G double emulsion under different storage conditions

由圖16可知，從外觀形態(tài)上看，C-3-G復(fù)乳呈粉紅色。當(dāng)在常溫下保存到第6天時(shí)，復(fù)乳已經(jīng)分層，體系破壞。而在4 ℃下保存的樣品，到2 周時(shí)形態(tài)未發(fā)生變化，表明復(fù)乳在4 ℃下可穩(wěn)定保存2 周。

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素試驗(yàn)及均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以復(fù)乳離心保留率為考察指標(biāo)，確定W/O/W復(fù)乳制備最優(yōu)工藝條件為：初乳攪拌速率15 500 r/min、復(fù)乳攪拌速率7 000 r/min、油相乳化劑PGPR添加量16%、親水性乳化劑HLB值10、親水性乳化劑添加量10%。利用上述復(fù)乳體系包埋C-3-G，所得復(fù)乳體系載藥量為1 500 mg/L，包封率為98.08%，粒徑為688.99 nm，電位為-27.61 mV，離心保留率為93.05%，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)表明復(fù)乳體系很好地包裹PGPR，為花色苷類(lèi)產(chǎn)品開(kāi)展更廣泛的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。