刁 巖，陳 斌，王 蕊，李 橋，趙海田，張 華，王 路，魏力軍,*，王振宇,*

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.中國航天員科研訓(xùn)練中心 航天營養(yǎng)與食品工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100094；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

多酚類化合物是一類在化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有相似性的化合物的統(tǒng)稱，其結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)為，均具有一個(gè)及一個(gè)以上的酚羥基結(jié)構(gòu)單元[1]。研究發(fā)現(xiàn)，多酚類化合物對飛行任務(wù)中航天員的多種生理或病理變化具有防護(hù)和修復(fù)作用的潛在能力[2-7]。天然植物多酚具有劑量小、效果強(qiáng)、生物活性多樣等特點(diǎn)，而這些使其成為良好的功能性食品添加劑。根據(jù)多酚類化合物結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)可將植物多酚劃分為酚酸類、類黃酮類、二苯乙烯類和木粉素類化合物[8-9]。松科植物體內(nèi)含有大量的多酚類化合物，具有一系列獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)和生物活性，統(tǒng)稱為松多酚（pine polyphenols fromPinus koraiensis，PPH）。研究發(fā)現(xiàn)該類物質(zhì)不但具有清除體內(nèi)自由基[10]、抑制脂質(zhì)過氧化[11]、抗癌抗腫瘤[12]、抗炎鎮(zhèn)痛[13]及抗菌抗病毒[14]等多種生理活性，還具有較好的輻射防護(hù)和修復(fù)的作用[15-16]和對失重骨丟失的防護(hù)作用[17]，能夠起到降血脂[18]、降血壓[19]、降血糖[20]、抗血栓[21]及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[22]的作用。人體每日攝取一定量的天然多酚能夠有效預(yù)防和抑制疾病的發(fā)生[23-24]。因此在空間飛行任務(wù)中具有防護(hù)航天員機(jī)體多種生理或病理改變的潛在能力。此外，PPH含有的酚羥基等多種官能團(tuán)，能通過氫鍵、疏水鍵或者共價(jià)鍵與高分子化合物接枝、共聚或共混也可與多種金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，從而制備出一系列新型先進(jìn)材料。

但是PPH化學(xué)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，其在體外極易被氧化失活，并且由于機(jī)體吸收PPH的部位在腸道，口服PPH經(jīng)過上消化道會使其生物活性降低或者全部喪失。本研究利用黑木耳多糖酸性片段（acidic polysaccharides fragments fromAuricularia auricula，AAP），通過聚電解質(zhì)自組裝原理將PPH包裹為PPH微粒并且將其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化以降低機(jī)體上消化道對PPH生物活性的影響。為多酚類物質(zhì)的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

紅松球果鱗片和黑木耳采自中國大興安嶺；多聚賴氨酸（polylysine，PLL） 北京索萊寶科技有限公司；乙醇（純度99.7%）、十六烷基三甲基溴化銨（99.5%）、硫酸（95%～98%） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；石油醚（99.8%） 天津嘉宇精細(xì)化工有限公司；沒食子酸（98%） 卡邁舒生物科技有限公司；丙酮（99.5%）、Folin-Ciocalteu試劑（98%） 天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；乙醚、NaCl（99.5%）、Na2CO3（99.5%）天津大茂化學(xué)試劑廠；苯酚（9 8%） 北京鼎國生物技術(shù)有限公司；葡萄糖（99.5%） 天津海晶精細(xì)化工廠；大孔樹脂（D101） 南開大學(xué)化工廠。

Infinite M200酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；ZHWY-211C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海志誠分析儀器有限公司；PB-10 pH計(jì) 賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；FD-18真空凍干機(jī)上海田楓實(shí)業(yè)有限公司；XL30掃描電鏡 荷蘭Philips公司；FP16072導(dǎo)電膠帶 北京中鏡科儀技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PPH的制備

將紅松球果鱗片在40 ℃條件下烘干，粉碎后過40 目篩。料液比1∶20（g/mL）加入60%乙醇溶液后，4 ℃放置5 h。取出后超聲（40 ℃）90 min，每隔30 min一次，3 次后放入4 ℃冰箱過夜。取出后，4 000 r/min離心10 min，取上清液用布氏漏斗過濾。旋轉(zhuǎn)真空濃縮至40%溶液后經(jīng)真空冷凍干燥得粉末。干燥粉末用蒸餾水溶解（固液比為1∶100（g/mL））后加入石油醚攪拌2 h后取水相加入Sevag試劑（5∶1，V/V）攪拌2 h。3 000 r/min離心取上清液經(jīng)真空冷凍干燥得紅松球果鱗片總多酚提取物粉末待用。

將紅松球果鱗片總多酚提取物的粉末用蒸餾水溶解，使多酚質(zhì)量濃度為1 mg/mL（以沒食子酸當(dāng)量計(jì)），利用大孔樹脂（D101）進(jìn)行進(jìn)一步純化。色譜柱直徑比高為1∶30，上樣量為1/4柱體積（1 mg/mL）。上樣后蒸餾水洗脫2 個(gè)柱體積，然后用60%乙醇溶液洗脫2 個(gè)柱體積（流速4 mL/min），并且每1/4柱體積收集1 次，一共收集8 次（S1～S8）。其中S3為PPH，其得率為（369.19±2.74）mg/g。

1.2.2 AAP的制備

將經(jīng)過干燥的黑木耳粉碎后過40 目篩。料液比1∶100（g/mL）加入蒸餾水后80 ℃水浴4 h。取出后超聲（80 ℃）90 min，每隔30 min一次。重復(fù)3 次后合并濾液4 000 r/min離心20 min。收集上清液濃縮，加入3 倍體積的95%乙醇溶液沉淀過夜。所得到的沉淀分別經(jīng)無水乙醇、丙酮和乙醚進(jìn)行清洗，溶于少量的去離子水凍干為粉末。干燥粉末用蒸餾水溶解（固液比為1∶100）后加入H2O2（9∶1，V/V）過夜。然后用Sevag法除去蛋白質(zhì)，加入Sevag試劑（5∶1，V/V）攪拌2 h。3 000 r/min離心取上清液，多次重復(fù)直到完全除去蛋白質(zhì)。上清液經(jīng)濃縮后加入3 倍體積的95%乙醇溶液沉淀24 h。所得到的沉淀分別經(jīng)無水乙醇、丙酮和乙醚進(jìn)行清洗，溶于少量的去離子水經(jīng)真空冷凍干燥得黑木耳多糖粉末。將黑木耳多糖粉末溶于蒸餾水中（1∶1 000）后加入3%的十六烷基三甲基溴化銨溶液直至無沉淀析出為止。4 000 r/min離心20 min后用4 mol/L NaCl溶解。將溶液透析、濃縮后加入3 倍體積的95%乙醇溶液沉淀24 h。所得到的沉淀分別經(jīng)無水乙醇、丙酮和乙醚進(jìn)行清洗，溶于少量的去離子水凍干為粉末。將粉末用蒸餾水溶解使其多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL（以葡萄糖當(dāng)量計(jì)）。利用Sephadex G-100對其進(jìn)行進(jìn)一步純化。色譜柱直徑比高為1∶30，樣品的上樣體積為10 mL（10 mg/mL）。以蒸餾水為洗脫液，洗脫速率為0.2 mL/min，通過收集器自動收集，并采用苯酚-硫酸法進(jìn)行多糖跟蹤檢測。收集最高主峰的多糖片段溶液經(jīng)真空冷凍干燥得AAP。AAP得率為（119.6±10.85）mg/g。

1.2.3 PPH質(zhì)量濃度的測定

采用改進(jìn)的Folin-Ciocalteu法測定PPH含量[25]。0.5 mL稀釋的樣品溶液被轉(zhuǎn)移到10 mL測試管，之后添加0.5 mL的Folin-Ciocalteu試劑，快速混勻，室溫靜置5 min，之后添加1.0 mL的10% Na2CO3溶液，并用蒸餾水校正總體積為3 mL，混勻，室溫避光靜置2 h。蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照，用紫外-可見分光光度計(jì)，于波長760 nm處測吸光度。以沒食子酸（0～70 μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.012 22x+0.012 256（R2=0.999 1，n=6，y為沒食子酸溶液的吸光度，x為沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL））。通過沒食子酸回歸方程和樣品溶液稀釋倍數(shù)計(jì)算多酚質(zhì)量濃度。

1.2.4 AAP質(zhì)量濃度的測定

采用苯酚-硫酸法[26]測定AAP含量。0.4 mL稀釋的樣品溶液被轉(zhuǎn)移到10 mL測試管，之后添加0.2 mL的5%苯酚溶液，混勻后加入1 mL的濃硫酸。將測試管置于沸水中加熱5 min，冷卻至室溫后，將溶液加入到96 孔板中（每孔200 μL），蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照，用紫外-可見分光光度計(jì)測量波長490 nm處吸光度。以葡萄糖（0～90 μg/mL）為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為y=2.315 51x+0.001 05（R2=0.999 6，n=6，y為葡萄糖溶液的吸光度，x為葡萄糖質(zhì)量濃度（μg/mL））。通過葡萄糖回歸方程和樣品溶液稀釋倍數(shù)計(jì)算AAP質(zhì)量濃度。

1.2.5 PPH微粒制備工藝單因素試驗(yàn)

1.2.5.1 AAP質(zhì)量濃度對PPH微粒包埋率的影響

pH 8.0的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）中使PLL（45 μg/mL）、PPH（120 μg/mL）與AAP（400、600、800、1 000、1 200 μg/mL）混合均勻后室溫?cái)嚢瑁?00 r/min）3 h。8 000 r/min離心5 min后取上清液測定多酚含量。按公式（1）計(jì)算包埋率：

式中：E為包埋率/%；PT為加入PPH的總量/μg；PS為上清液中PPH含量/μg。

1.2.5.2 PLL質(zhì)量濃度對PPH微粒包埋率的影響

pH 8.0的PBS中使AAP（800 μg/mL）、PPH（120 μg/mL）與PLL（5、15、25、35、45 μg/mL）混合均勻后室溫?cái)嚢瑁?00 r/min）3 h。8 000 r/min離心5 min后取上清液測定多酚含量，并按公式（1）計(jì)算包埋率。

1.2.5.3 PPH質(zhì)量濃度對PPH微粒包埋率的影響

pH 8.0的PBS中使AAP（800 μg/mL）、PLL（25 μg/mL）與PPH（40、60、80、100、120 μg/mL）混合均勻后室溫?cái)嚢瑁?00 r/min）3 h。8 000 r/min離心5 min后取上清液測定多酚含量。按公式（1）計(jì)算包埋率。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)測定的水平范圍，應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件，按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)定3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，將包埋率作為響應(yīng)值，AAP質(zhì)量濃度、PLL質(zhì)量濃度以及PPH質(zhì)量濃度分別編碼為X1、X2和X3，對PPH微粒的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in Box-Behnken design

1.2.7 PPH微粒形貌觀察

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化的參數(shù)，將PPH微粒制備完成后加入蒸餾水洗滌2 次。8 000 r/min離心5 min后加入無水乙醇重懸。將重懸液滴在導(dǎo)電銅片上。待乙醇揮發(fā)后經(jīng)過表面噴金處理，用掃描電子顯微鏡觀察并拍照。

1.2.8 PPH微粒載藥量的測定

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化的參數(shù)，pH 8.0的PBS中使PLL、PPH與AAP混合均勻后室溫?cái)嚢瑁?00 r/min）3 h。8 000 r/min離心5 min后取上清液測量多酚含量。沉淀用蒸餾水洗2 次后進(jìn)行真空冷凍干燥。準(zhǔn)確稱量PPH微粒的質(zhì)量。按公式（2）計(jì)算載藥量：

式中：D為載藥量/%；M為PPH微粒的質(zhì)量/μg。

1.2.9 PPH微粒的體外緩釋

模擬體外胃環(huán)境觀察PPH微粒釋放率：以pH值為1.2的人工胃液為釋放介質(zhì)，取10 mL緩沖溶液于15 mL離心管中。稱取6 份PPH微粒每份200 mg置于釋放介質(zhì)中。將離心管放在浴恒溫振蕩器內(nèi)，37 ℃、80 r/min勻速振蕩。分別在1、2、3、4、5、6 h后8 000 r/min離心。15 min后棄去上清液，將沉淀用蒸餾水洗凈后，真空冷凍干燥并且稱量剩余質(zhì)量。根據(jù)載藥量計(jì)算PPH微粒釋放率。

模擬體外腸環(huán)境觀察微球釋放量：以pH值為7.4的人工腸液（PBS）為釋放介質(zhì)，取10 mL緩沖溶液于15 mL離心管中。稱取6 份PPH微粒每份200 mg置于人工胃液介質(zhì)中37 ℃，以80 r/min勻速振蕩6 h后8 000 r/min離心。15 min后棄去上清液，將沉淀用蒸餾水沖洗3 遍，然后將沉淀置于人工腸液中。將離心管放在浴恒溫振蕩器內(nèi)，溫度調(diào)至37 ℃，以80 r/min速率勻速振蕩。分別在1、2、3、4、5、6 h后8 000 r/min離心15 min。將沉淀用蒸餾水洗凈后，真空冷凍干燥并且稱量剩余質(zhì)量。根據(jù)載藥量計(jì)算PPH微粒釋放率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本研究中所有數(shù)據(jù)由SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)得出，結(jié)果表示為 ±s。P＜0.05，差異顯著。數(shù)據(jù)均通過3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

AAP是一種帶有羧基的多糖片段，也是一種帶有陰離子基團(tuán)的聚電解質(zhì)，根據(jù)聚電解質(zhì)自組裝原理，利用帶有陽離子基團(tuán)的聚電解質(zhì)，通過二者在水溶液中可以自發(fā)的組裝，從而將PPH包裹來制備PPH微粒。因此，首先對AAP、PLL與PPH在水溶液中的質(zhì)量濃度對PPH微粒的包埋率進(jìn)行檢測。

圖1 AAP質(zhì)量濃度（A）、PLL質(zhì)量濃度（B）、PPH質(zhì)量濃度（C）對PPH微粒包埋率的影響Fig. 1 Effects of AAP (A), PLL (B) and PPH (C) concentration on encapsulation efficiency

如圖1A所示，PPH微粒的包埋率隨著AAP質(zhì)量濃度的增大而增加。當(dāng)AAP質(zhì)量濃度為800 μg/mL時(shí)，PPH微粒的包埋率出現(xiàn)最大值（83.84±1.34）%，隨后繼續(xù)增加AAP的質(zhì)量濃度包埋率變化極其緩慢，并在此后呈現(xiàn)較平穩(wěn)趨勢。因此在PLL和PPH質(zhì)量濃度確定時(shí)應(yīng)選取800 μg/mL作為AAP的最佳質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

如圖1B所示，PPH微粒的包埋率隨著PLL質(zhì)量濃度的增大而增加。當(dāng)PLL質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)，PPH微粒的包埋率出現(xiàn)最大值（84.44±0.98）%，隨后繼續(xù)增加PLL的質(zhì)量濃度包埋率迅速降低。這是因?yàn)殡S著PLL質(zhì)量濃度的不斷增加，當(dāng)其與AAP質(zhì)量濃度的比例超過一個(gè)臨界點(diǎn)時(shí)，溶液中聚電解質(zhì)的自組裝方式發(fā)生改變[27]。當(dāng)AAP過量時(shí)，其與PLL在溶液中組裝成緊湊形式的微粒[28]，而當(dāng)PLL過量時(shí)，其與AAP在溶液中組裝成松散形式的微粒[29]。因此在AAP和PPH質(zhì)量濃度確定時(shí)應(yīng)選取25 μg/mL作為PLL的最佳質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

如圖1C所示，PPH微粒的包埋率隨著PPH質(zhì)量濃度的增大而增加。當(dāng)PPH質(zhì)量濃度為80 μg/mL時(shí)，PPH微粒的包埋率出現(xiàn)最大值（83.48±0.56）%，隨后繼續(xù)增加PPH的質(zhì)量濃度包埋率變化較為緩慢，并在此后呈現(xiàn)略微降低的趨勢。因此在AAP和PLL質(zhì)量濃度確定時(shí)應(yīng)選取80 μg/mL作為PLL的最佳質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

在各單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，以PPH微粒包埋率（Y）作為響應(yīng)值，以AAP質(zhì)量濃度（X1）、PLL質(zhì)量濃度（X2）和PPH質(zhì)量濃度（X3）作為自變量，建立3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。利用Design-Expert軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析，如表2所示。

對設(shè)計(jì)方案中17 組試驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用Design-Expert軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到以包埋率Y為響應(yīng)值，X1、X2、X3為自變量的二次多項(xiàng)回歸方程，回歸方程為：Y=85.46+1.37X1+2.59X2+0.98X3-0.59X1X2+3.14X1X3+1.51X2X3-3.92-1.88-4.57。

如表3所示，模型項(xiàng)顯著，其擁有較高的F值（108.69），較低的P值（P＜0.000 1）。并且該模型失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）表明模型建模成功。由表3二次多項(xiàng)回歸方程方差分析可知，決定系數(shù)（R2=0.992 9）接近1，說明該模型實(shí)際值與預(yù)測值擬合性較高；校正系數(shù)（R2Adj=0.983 8）較大，即表明模型可以解釋98.38%的PPH微粒包埋率的變化，即大多數(shù)變異可以被該模型預(yù)測，進(jìn)一步說明了回歸方程擬合度較好；變異系數(shù)（0.7%）較小，表明試驗(yàn)可靠性較高[30]?？梢杂么四Ｐ蛯υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和預(yù)測。除交互因素X1X2不顯著（P＞0.05）外，其余項(xiàng)對該模型均有顯著（P＜0.01）作用。這說明各因素對響應(yīng)值的影響不是直接線性關(guān)系[31]。交互因素X1X2不顯著，即AAP與PPH的質(zhì)量濃度交互作用不顯著。但是交互因素X1X3和X2X3顯著，即APP與PLL質(zhì)量濃度以及PPH與PLL質(zhì)量濃度的交互作用顯著。這是由于PPH為多酚類化合物，在堿性條件（pH 8.0）下酚羥基可以失去一個(gè)質(zhì)子而使基團(tuán)帶負(fù)電荷。而PLL為帶正電荷的陽離子聚電解質(zhì)，可以通過靜電引力將PPH吸附，從而通過聚電解質(zhì)自組裝反應(yīng)組裝成微粒結(jié)構(gòu)。但是AAP為陰離子聚電解質(zhì)，也帶有負(fù)電荷可與PPH分子產(chǎn)生靜電斥力而不利于微粒的形成。所以會產(chǎn)生交互因素X1X2不顯著而交互因素X1X3和X2X3顯著的結(jié)果。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of regression model

圖2 各因素交互作用對PPH微粒包埋率的響應(yīng)面與等高線圖Fig. 2 Response surface and contour plots showing the interactive effects of factors on encapsulation efficiency

3D響應(yīng)面和等高線代表兩個(gè)變量之間的交互作用，以及每一變量的試驗(yàn)水平與響應(yīng)值之間的關(guān)系[32]。圖2可直觀地反映各因素及其交互作用對PPH微粒包埋率的影響結(jié)果。其中等高線的形狀可以反映2 個(gè)變量之間交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示2 個(gè)變量間交互作用較強(qiáng)，圓形則表示較弱[33-34]。在控制2 個(gè)自變量之外的因素不變的情況下，2 個(gè)有交互的自變量對響應(yīng)值的影響也可以從響應(yīng)面圖的曲面上看出[35]。如圖2所示，從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高線可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值，既是響應(yīng)面的最高點(diǎn)，同時(shí)也是等高線最小橢圓的中心點(diǎn)。

由圖2a可知，PPH和AAP質(zhì)量濃度對PPH微粒包埋率的交互作用較弱。表現(xiàn)為PPH質(zhì)量濃度變化對PPH微粒包埋率變化的影響相對較小，響應(yīng)面的坡度較緩；AAP質(zhì)量濃度變化對PPH微粒包埋率變化的影響較大，響應(yīng)面的坡度較陡。由圖2b可知，PLL和AAP質(zhì)量濃度對PPH微粒包埋率的交互作用較強(qiáng)。表現(xiàn)為PLL質(zhì)量濃度和AAP質(zhì)量濃度對PPH微粒包埋率變化的影響均較大，響應(yīng)面的坡度較陡。從圖2c可知，PLL和PPH質(zhì)量濃度對PPH微粒包埋率的交互作用較強(qiáng)。表現(xiàn)為PLL質(zhì)量濃度變化對PPH微粒包埋率變化的影響較大，響應(yīng)面的坡度較陡；PPH質(zhì)量濃度變化對PPH微粒包埋率變化的影響相對較小，響應(yīng)面的坡度較緩。

2.3 最優(yōu)工藝條件的預(yù)測及驗(yàn)證

對回歸方程求解，AAP質(zhì)量濃度為897.82 μg/mL、PPH質(zhì)量濃度為111.17 μg/mL以及PLL質(zhì)量濃度為31.4 μg/mL時(shí)PPH微粒的包埋率為最大值（86.8%）。為比較實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性，考慮到實(shí)際實(shí)驗(yàn)的可操作性，將最優(yōu)的預(yù)測條件進(jìn)行修正后對模型進(jìn)行實(shí)際驗(yàn)證。即實(shí)際操作實(shí)驗(yàn)條件為AAP質(zhì)量濃度900 μg/mL、PPH質(zhì)量濃度110 μg/mL以及PLL質(zhì)量濃度30 μg/mL，此時(shí)的PPH微粒包埋率為（86.57±1.07）%，載藥量為（24.03±0.81）%。結(jié)果表明，經(jīng)過響應(yīng)回歸方程擬合出的理論值與實(shí)際值偏差小，證明用響應(yīng)面法對優(yōu)化紅所多酚微粒的制備工藝有指導(dǎo)意義。

2.4 優(yōu)化后PPH微粒的形貌及其體外緩釋模擬

圖3 PPH微粒的形貌（A）及其體外緩釋模擬（B）Fig. 3 SEM picture of pinecone polyphenols microparticles (A) and release rate of PPH in simulated gastric and intestinal environments (B)

如圖3所示，微粒的直徑在200～500 nm左右。無論在模擬胃環(huán)境或是腸道環(huán)境中，微粒多酚的釋放量均隨著時(shí)間的延長逐漸升高。但是在模擬胃環(huán)境中直到6 h后其多酚釋放量也僅有（6.50±0.14）%，而在模擬腸道環(huán)境中6 h后PPH微粒的多酚釋放量為（87.84±2.912）%，遠(yuǎn)大于模擬胃環(huán)境中的釋放量。

3 結(jié) 論

本研究利用聚電解質(zhì)自組裝原理將PPH制備為PPH微粒，并且在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對響應(yīng)面法制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。建立AAP質(zhì)量濃度、PPH質(zhì)量濃度和PLL質(zhì)量濃度對PPH微粒包埋率的二次回歸方程模型，經(jīng)驗(yàn)證，該數(shù)學(xué)模型可靠，可以用于PPH微粒包埋率的預(yù)測。結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化模型確定PPH微粒制備工藝參數(shù)為AAP質(zhì)量濃度900 μg/mL、PPH質(zhì)量濃度110 μg/mL以及PLL質(zhì)量濃度30 μg/mL。在此最優(yōu)條件下，PPH微粒包埋率為（86.57±1.07）%，載藥量為（24.03±0.81）%。優(yōu)化后的PPH微粒直徑為200～500 nm，其在模擬胃環(huán)境中釋放率較低而在模擬腸環(huán)境中釋放率較高。