買買提·依斯熱依力，艾克拜爾·艾力，買買提艾力·艾則孜，吾布力卡斯木·吾拉木，李義亮，阿孜古麗·阿力木江，閆 晶，克力木·阿不都熱依木

(1. 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院普外微創(chuàng)研究所，2. 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院微創(chuàng)，疝和腹壁外科，3. 新新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院心外科，4. 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科門診，新疆 烏魯木齊 830001)

尿酸(uric acid, UA)是核酸中嘌呤堿基代謝的最終產(chǎn)物，嘌呤合成過程中的產(chǎn)物次黃嘌呤、黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XO)的催化作用下產(chǎn)生UA[1]。高尿酸血癥不僅導(dǎo)致痛風(fēng)，而且與代謝綜合征(metabolic syndrome, Met S)關(guān)系密切。據(jù)報道，高尿酸血癥諸多生活方式相關(guān)慢性病(如高血壓、2型糖尿病、肥胖等)發(fā)生發(fā)展中的重要危險因素[2]。現(xiàn)代工作和生活方式中慢性心理壓力與Met S、高尿酸血癥、糖尿病和血栓栓塞癥的發(fā)生密切相關(guān)。心理壓力可激活機(jī)體各種應(yīng)激途徑，包括下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感神經(jīng)系統(tǒng)，最終導(dǎo)致應(yīng)激相關(guān)的疾病[3]。慢性心理壓力可對心血管、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)帶來不良的影響。

脂肪組織不僅是一個被動的能量儲存的器官，它還是一個調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌、能量代謝及炎癥的內(nèi)分泌器官。在各種異常的生理代謝如高尿酸、血脂異常、胰島素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病的發(fā)生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4]。脂肪組織中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的積聚，被認(rèn)為Met S的早期誘因和潛在治療靶點(diǎn)。因此，本研究通過建立小鼠慢性束縛應(yīng)激(Stress)模型，探討心理應(yīng)激誘導(dǎo)UA形成、脂肪炎癥、胰島素抵抗和凝血酶原狀態(tài)發(fā)生中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑

自制式束縛器；電子天平(EL-5.2K)，常州市天之平儀器設(shè)備有限公司；低溫高速離心機(jī)(1-14K)，美國Sigma公司；光學(xué)顯微鏡(Eclipse E200)，日本尼康公司；梯度PCR擴(kuò)增儀(C1000)，美國Bio-Rad公司；PBS緩沖液粉末、HE染色相關(guān)試劑、DAB顯色試劑盒、免疫組化通用試劑盒，均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；XO抗體(貨號：EPR4605)、Nox-4抗體(貨號：UOTR1B493)購于美國Abcam公司；檸檬酸，美國Sigma公司；TRIzol試劑，美國Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒，北京天根生化科技有限公司；實(shí)時定量RT-PCR試劑盒，日本TaKaRa公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組

SPF級雄昆明(KM)小鼠25只，8周齡，購于新疆實(shí)驗(yàn)動物研究中心，許可證號：SCXK(新)2011-0001；飼養(yǎng)于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所IVC系統(tǒng)動物中心。25只小鼠進(jìn)行編號及體重測量，并排除體重變異較大的5只。采用Microsoft Office Excel軟件隨機(jī)分2組(各10只)，即慢性束縛應(yīng)激(Stress)組和正常對照(Control)組。小鼠單只飼養(yǎng)在自由進(jìn)食水的鼠籠內(nèi)，每日給予12 h晝夜循環(huán)，光照均始于8:30 分，止于20:30分。

1.3 Stress模型的建立

所有小鼠在相同環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。該模型的心理應(yīng)激屬性為慢性束縛應(yīng)激，束縛應(yīng)激均在每日上午10:30～12:30進(jìn)行。10只Stress組小鼠置于用50 ml離心管所制的自制式束縛器中(離心管提前燙制出直徑約5 mm的通氣孔若干，分布于左右及上側(cè)管壁，管口塑料蓋做1小孔以暴露小鼠尾巴)，每日限制活動2 h，期間禁食禁水，后放回鼠籠內(nèi)自由活動，連續(xù)束縛14 d。Control組小鼠自由飲水?dāng)z食，其余時間兩組小鼠處理相同。兩組小鼠實(shí)驗(yàn)過程中3 d 1次進(jìn)行測量體重及飲食量。

1.4 取材與標(biāo)本處理

束縛應(yīng)激第14日下午17:00開始對所有小鼠禁食，于次日11:00進(jìn)行取材。麻醉的小鼠以平臥位固定，從腹部正中至劍突取切口取3 cm切口，下腔靜脈取血注入于1.5 ml EP管中。腹部及皮下脂肪剪斷取材，先進(jìn)行腹部脂肪重量測量，然后置于4%中性甲醛固定；檢測兩組WAT組織中XO，Nox-4的蛋白水平，檢測WAT組織中XO、Nox-4、Mn SOD、GSH-Px、CAT、ADPN、MCP-1、IL-6、TNF-α、IRS-1、GLUT-4、TF以及PAI-1的mRNA表達(dá)。

1.5 脂肪組織病理學(xué)檢查

脂肪標(biāo)本4%中性甲醛固定24 h后水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4 μm厚切片行HE染色。各組脂肪組織常規(guī)HE染色后，切片質(zhì)量及組織形態(tài)學(xué)改變均由富有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師診斷。

1.6 免疫組化染色

脂肪組織石蠟切片脫蠟水化后，10%過氧化氫甲醛阻斷過氧化物酶，檸檬酸法高壓修復(fù)抗原，山羊血清封閉1 h，分別在不同切片滴加XO和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH oxidase，Nox-4)一抗(1∶100，均購于abcam)，4℃過夜，滴加二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色。以PBS 液取代一抗作為陰性對照。每只小鼠脂肪組織標(biāo)本隨機(jī)取兩張切片，光鏡下觀察脂肪組織染色情況，在200倍鏡下隨機(jī)取5個視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行拍照，以明顯黃色/棕黃色細(xì)胞為陽性細(xì)胞。

1.7 實(shí)時定量RT-PCR

采用實(shí)時定量RT-PCR方法檢測各項(xiàng)指標(biāo)的mRNA的相對表達(dá)。取每只小鼠脂肪組織20 mg，采用TRIzol試劑提取總RNA，采用天根公司Fast Quant RT試劑盒合成第一鏈cDNA。由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計并合成引物，各指標(biāo)及β-肌動蛋白(actin)引物序列見表1。RT-PCR反應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。實(shí)時定量RT-PCR，反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件為: 94℃ 3 min，然后95℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后由電腦自動得出熒光曲線及Ct值，采用2-△△Ct計算出Stress小鼠脂肪組織相對于Control組中目標(biāo)基因的相對表達(dá)倍數(shù)。

Tab. 1 Sequences of primers used for RT-PCR

1.8 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定

取血后不經(jīng)任何處理，4℃下靜置2 h，之后以 3 500 r/min的速度低溫離心5 min，取上層血清，-80℃保存，用于后續(xù)測定。ELISA法檢測WAT組織中XO酶活性，血清中甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, T-Cho)、游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)、Nox-4及UA的含量。實(shí)驗(yàn)過程及測量指標(biāo)濃度的計算嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 心理應(yīng)激對小鼠WAT組織XO表達(dá)和酶活性的影響

XO免疫染色陽性著色細(xì)胞在Stress小鼠腹股溝WAT組織中表達(dá)較Control組黃褐色沉淀深且豐富，主要表達(dá)于脂肪細(xì)胞中(圖1)。Stress組WAT組織中XO mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于Control組(P<0.01)。Stress組血清XO濃度以及WAT組織中XO、XOR的酶活性顯著高于Control組(P<0.01，表2)。

Fig. 1 Expressions of XO in the WAT of control and stressed mice(Immunohistochemistry ×200)

GroupXO mRNAXO(mU/ml)Activity(nmolsIXP/min/μg)XOXORControl1.00±0.0012.47±4.631.25±0.081.37±0.14Stress2.45±0.52??29.34±5.27??4.06±0.65??4.52±1.05??

**P<0.01vscontrol

2.2 心理應(yīng)激對小鼠血生化指標(biāo)的影響

Stress組WAT組織重量與Control組相比顯著降低(P<0.01)；Stress組小鼠血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-Cho)的釋放濃度有上升的趨勢，但與Control組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；而Stress組游離脂肪酸(FFA)以及尿酸(UA)的含量顯著增高，約為Control組的2倍，兩組間具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表3)。

Tab. 3 White adipose tissues(WAT) weight and blood parameters of control and stress n=10)

**P<0.01vscontrol

2.3 心理應(yīng)激對小鼠WAT組織中Nox-4和抗氧化蛋白表達(dá)的影響

Stress組WAT組織Nox-4陽性表達(dá)細(xì)胞與control組相比，黃褐色沉淀深且豐富，主要表達(dá)于脂肪細(xì)胞中(圖2)。Stress組小鼠WAT組織中Nox-4的mRNA表達(dá)水平及其血清濃度顯著高于Control組(P<0.01，表4)；Stress組WAT組織中抗氧化蛋白如錳超氧化物歧化酶( Mn-SOD )、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及過氧化氫酶(Catalase)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.01，表5)。

Fig. 2 Expressions of Nox-4 in the WAT of control and stressed mice(Immunohistochemistry ×200)

GroupNox-4 mRNANox-4(ng/ml)Control1.00±0.000.65±0.04Stress2.48±0.37??2.75±0.77??

**P<0.01vscontrol

GroupMn SOD mRNAGSH-Px mRNACatalase mRNAControl1.00±0.001.00±0.001.00±0.00Stress0.62±0.05??0.60±0.03??0.57±0.02??

**P<0.01vscontrol

2.4 心理應(yīng)激對小鼠脂肪組織的影響

HE染色鏡下觀察發(fā)現(xiàn)(圖3)，Stress組小鼠WAT出現(xiàn)大量的單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤反應(yīng)和炎癥性改變，而Control組小鼠WAT未發(fā)現(xiàn)異常。

Fig. 3 HE staining in the WAT of control and stressed mice(HE staining ×200)

2.5 心理應(yīng)激對小鼠脂肪組織細(xì)胞因子表達(dá)的影響

Stress組小鼠WAT組織中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平與Control組相比顯著增高，兩組間具有明顯的差異(P<0.01，表6)；在Stress組WAT組織中Adiponectin(ADPN)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著低于Control組(P<0.01，表6)。

2.6 心理應(yīng)激對小鼠脂肪組織糖代謝相關(guān)蛋白和促凝血因子表達(dá)的影響

Stress組WAT組織中胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1, IRS-1)及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter-4, GLUT-4)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著底于Control組(P<0.01，表7)。Stress組WAT組織中纖溶酶原激活物抑制因子-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)及組織因子(tissue factor, TF)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于Control組(P< 0.01，表7)。

Tab. 6 The mRNA expressions of adipocytokines in the WAT of control and stressed n=10)

**P<0.01vscontrol

Tab. 7 Expressions of glucose and prothrombic biomarkers in the WAT of two group

**P<0.01vscontrol

3 討論

高尿酸血癥是心血管、內(nèi)分泌和腎臟疾病的獨(dú)立危險因素，同時諸多疾病如痛風(fēng)、2型糖尿病、高血壓和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[5]。UA結(jié)晶可沉積于血管內(nèi)皮細(xì)胞，直接誘發(fā)血管內(nèi)皮的損傷，可導(dǎo)致血液中脂質(zhì)沉積于損傷的內(nèi)皮細(xì)胞下，誘發(fā)動脈粥樣硬化。過量的UA形成尿酸結(jié)晶沉積于胰島β細(xì)胞，干擾其功能，進(jìn)而引發(fā)糖代謝紊亂，促進(jìn)糖尿病的發(fā)生[6]。UA可以引起脂肪MCP-1的產(chǎn)生增加，而激發(fā)脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)；UA使脂聯(lián)素(adiponectin)的合成減少，而引起脂肪細(xì)胞特異性胰島素減少[7]。高水平的UA可通過ROS產(chǎn)生、活化核轉(zhuǎn)錄因子κB誘導(dǎo)型一氧化氮合酶NO信號通路或激活A(yù)MP活化蛋白激酶信號通路來抑制胰島β細(xì)胞增殖或增加其凋亡[8]。

黃嘌呤氧化還原酶(xanthine oxidoreductase, XOR)是一種含鉬蛋白的酶，能催化次黃嘌呤氧化為黃嘌呤，最后氧化形成為UA。XOR以兩種形式存在：黃嘌呤脫氫酶(xanthine dehydrogenase, XDH)，傾向于NAD+電子受體和黃嘌呤氧化酶(XO)，通過XDH翻譯后修飾而衍生，并產(chǎn)生活性氧(ROS)超氧化物[9]。在動物內(nèi)臟脂肪XOR的表達(dá)水平和酶活性較高，類似于肝臟和腸道。脂肪組織是一個重要的內(nèi)分泌器官，可分泌瘦素(leptin)、Adiponectin、腫瘤壞死因子(TNF-α)、MCP-1等多種脂肪細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子與許多疾病的生理和病理過程有關(guān)[10]。Adiponectin在調(diào)節(jié)糖脂代謝中發(fā)揮著重要的作用，它可以促進(jìn)血漿中FFA氧化，提高胰島素敏感性，增加外周組織對葡萄糖的攝取，抑制肝臟葡萄糖輸出和葡萄糖再生。2型糖尿病是最常見的慢性病之一，全球大約1.5億糖尿病患者。通常認(rèn)為2型糖尿病患者的胰島素水平并不降低，但是肝臟、肌肉及脂肪組織等外周器官存在胰島素抵抗。臨床研究發(fā)現(xiàn)，血尿酸水平和高尿酸血癥發(fā)病率隨體重指數(shù)(BMI)增加而增加。高脂血癥患者60%～80%伴有高尿酸血癥，血尿酸濃度與甘油三酯和總膽固醇水平呈正相關(guān)[11-12]。

胰島素抵抗通常是與體重增加及心血管功能異常存在相關(guān)性，Adiponectin、TNF-α和IL-6是在這些病理狀態(tài)的重要分子。在這些細(xì)胞因子中，只有Adiponectin的血漿水平在胰島素抵抗和肥胖的情況下降低，在合并冠心病的患者中降低更加明顯，在胰島素敏感性增加和體重減輕時Adiponectin的表達(dá)和血漿水平上升，同時有研究顯示，血漿Adiponectin高的冠心病患者將來心肌梗死的危險性降低[13]。此外，Adiponectin還具有抗炎、抗動脈粥樣硬化的功能。研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血漿Adiponectin的含量較正常人低，Adiponectin通過抑制NF-κB的激活來抑制TNF-α誘導(dǎo)的單核細(xì)胞粘附和血管內(nèi)皮粘附分子如血管細(xì)胞粘附分子-1的表達(dá)，并抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，提示Adiponectin在動脈粥樣硬化形成過程中發(fā)揮著保護(hù)作用[14]。

ROS不但是細(xì)胞代謝的有害副產(chǎn)物，而且是細(xì)胞信號傳導(dǎo)和基因調(diào)控的主要參與者。過量的ROS不僅可直接對機(jī)體和組織細(xì)胞產(chǎn)生損傷，而且最近的研究發(fā)現(xiàn)微量的ROS在細(xì)胞內(nèi)可作為信號分子，通過調(diào)節(jié)與炎癥有關(guān)的基因表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)[15]。心理壓力增高是誘導(dǎo)ROS發(fā)生的重要機(jī)制，而ROS也在Met S，冠心病，2型糖尿病等諸多疾病的進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。ROS是激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路的主要介導(dǎo)劑，抗氧劑在降低ROS含量的同時抑制NF-κB激活[16]。NADPH為細(xì)胞內(nèi)一組具有氧化活性的酶復(fù)合體，是主要的ROS來源，它通過催化NADPH的單電子氧化將單個電子傳遞給氧分子，產(chǎn)生超氧陰離子自由基，由6種不同的亞基構(gòu)成，其中Nox-4與ROS關(guān)系較密切的氧化酶[17]?；钚匝醴e累與Nox-4的活性增加有關(guān)。Nox-4廣泛存在于多種組織或細(xì)胞內(nèi)如心血管內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞[18]、脂肪細(xì)胞[19]、腎小管[20]等。

由于UA的臨床意義重大，國內(nèi)外學(xué)者討論心理壓力與血清尿酸(serum uric acid, SUA)水平之間的關(guān)系，然而尚未闡明其如何影響UA代謝的機(jī)制。機(jī)體受到心理應(yīng)激作用導(dǎo)致ROS產(chǎn)生過多，超出機(jī)體氧化物的清除能力，使得氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，而引起氧化損傷的加重。本研究結(jié)果表明，stress誘導(dǎo)小鼠脂肪組織XO表達(dá)顯著增高，進(jìn)而導(dǎo)致UA的過量產(chǎn)生；并進(jìn)一步引起脂肪組織中ROS指標(biāo)(Nox-4)、抗氧化蛋白(Mn SOD、GSH-Px、Catalase)的表達(dá)異常，證明了心理應(yīng)激誘導(dǎo)XO和Nox-4的過量產(chǎn)生是破壞脂肪氧化/抗氧化防御平衡的主要原因。脂肪組織中巨噬細(xì)胞是促炎因子的主要來源之一，并促使慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生；本研究發(fā)現(xiàn)，stress誘導(dǎo)脂肪組織單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤反應(yīng)和炎癥性改變；同時stress誘導(dǎo)Adiponectin的表達(dá)降低以及導(dǎo)致脂肪細(xì)胞因子如MCP-1、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)量顯著升高，與control組相比存在明顯差異；更重要的是，接受為期14 d的心理應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠脂肪分解(FFA)、糖代謝(IRS-1、GLUT-4)及促凝血因子(TF、PAI-1)表達(dá)異常。因此，我們認(rèn)為脂肪組織氧化/抗氧化防御系統(tǒng)的平衡在維持脂肪穩(wěn)態(tài)、炎癥、高尿酸、糖代謝以及血栓形成中起關(guān)鍵作用。根據(jù)本研究結(jié)果，我們認(rèn)為心理應(yīng)激使脂肪組織氧化、抗氧化防御系統(tǒng)受損，進(jìn)而出現(xiàn)脂肪細(xì)胞因子的異常表達(dá)，可能是心理壓力相關(guān)高尿酸、糖代謝和凝血功能異常發(fā)生的機(jī)制之一。