張麗華 王婷 陳群 王曉立 韓浩章

摘? 要：Argonautes（AGOs）蛋白是生物有機(jī)體中普遍存在的一類比較保守的蛋白質(zhì)，在不同物種的RNAi及相關(guān)的途徑中具有十分重要的功能，也調(diào)控著模式植物擬南芥的生長發(fā)育過程。該研究利用AGO蛋白的保守域在毛果楊基因組中進(jìn)行同源比對，鑒定出毛果楊A(yù)GO基因家族成員13個，并對其成員進(jìn)行了理化性質(zhì)分析、motif結(jié)構(gòu)比對、進(jìn)化樹構(gòu)建、基因表達(dá)分析等。結(jié)果表明：毛果楊A(yù)GO基因家族成員基因長度為2463～3189bp，編碼的蛋白質(zhì)具有保守的Piwi、PAZ、DUF1785 結(jié)構(gòu)域。PtAGO 基因分布于第1、6、8、9、10、12、14、15、16條染色體上，存在著串聯(lián)重復(fù)序列。AGO 蛋白定位于葉綠體、細(xì)胞核和胞質(zhì)中，偏堿性和親水性，具有較高的脂溶指數(shù)、不穩(wěn)定性?；蚪M織表達(dá)分析表明，毛果楊PtAGO成員在不同組織中的表達(dá)有明顯差異，在與木材形成相關(guān)的組織、器官中有較高的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：毛果楊;AGO蛋白;基因家族;生物信息

中圖分類號 S792.11文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）04-0012-04

Abstract：Argonautes（AGOs） proteins are a class of relatively conserved proteins ubiquitous in biological organisms，and play important roles in RNAi and related pathways of different species，and also regulate the growth and development of model plants Arabidopsis thaliana.In this study，a conserved domain of AGO protein was used to perform homologous alignment in the genome of P. simonii，and 13 members of AGO gene family of P. simonii were identified，and physical and chemical properties，motif alignment，phylogenetic tree construction，Gene expression analysis，etc.The results showed that the AGO gene family members were 2463-3189 bp in length，and the encoded proteins had conserved Piwi，PAZ and DUF1785 domains.The PtAGO gene is distributed on chromosomes 1，6，8，9，10，12，14，15，and 16 with tandem repeats.AGO protein is localized in chloroplast，nucleus and cytoplasm，alkaline and hydrophilic，with high fat solubility index and instability.The analysis of gene tissue expression showed that the expression of PtAGO members in different tissues was significantly different，and it was highly expressed in tissues and organs related to wood formation.

Key words：Populus trichocarpa;AGO protein;Gene family;Bioinformation

AGO（Argonaute）基因普遍存在于各類生物基因組中，不同生物的AGO蛋白結(jié)構(gòu)相對保守，通常有PAZ和PIWI 2個特征域。在小RNA分子介導(dǎo)的RNA沉默途徑中，AGO蛋白是沉默復(fù)合物的主要成分[1]，AGO蛋白可以與這些小RNA介導(dǎo)的不同類型的小非編碼RNA結(jié)合，特異性結(jié)合小RNA互補(bǔ)靶的靶RNA，靶基因被AGO蛋白本身的核酸內(nèi)切酶活性切割，從而導(dǎo)致靶基因的失活[2]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AGO基因家族中有10個成員，主要分為3類[3]。在多種植物中，例如擬南芥和水稻，AGO蛋白和小RNA形成調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育的復(fù)合物，它在應(yīng)激反應(yīng)和防御病毒入侵方面發(fā)揮了重要作用[4]。不同物種的AGO蛋白可以通過協(xié)同作用控制植物的生長和發(fā)育[5]。

目前，對毛果楊Populus trichocarpa AGO基因（PtAGO）功能的研究仍然滯后。本文系統(tǒng)研究了PtAGO蛋白家族域的序列比對，系統(tǒng)發(fā)育樹和AGO蛋白的理化性質(zhì)，以此為進(jìn)一步研究PtAGO基因家族的功能與作用提供理論依據(jù)，也為進(jìn)一步研究PtAGO蛋白在RNAi等相關(guān)途徑中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 數(shù)據(jù)來源與分析方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 本研究以毛果楊為實(shí)驗對象，包括國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）和毛果楊基因組數(shù)據(jù)（植物基因組數(shù)據(jù)站點(diǎn)植物組學(xué)）。

1.2 分析方法

1.2.1 Argonaute蛋白基因的搜索與確認(rèn) 在毛果楊（Populus trichocarpa）基因組中發(fā)現(xiàn)每種AGO蛋白的同源序列作為候選蛋白。在獲得與候選蛋白質(zhì)序列類似的AGO基因后，這些基因用作二級查詢的序列，繼續(xù)搜索并多次查找和補(bǔ)充以確定毛果楊中所有替代AGO家族成員。然后在PFAM和SMART蛋白結(jié)構(gòu)域在線分析預(yù)測位點(diǎn)上分析所有候選基因的候選蛋白結(jié)構(gòu)域，并且得到的基因是Populus trichocarpa的AGO基因家族的所有成員。

1.2.2 毛果楊A(yù)rgonaute基因家族的基因網(wǎng)站查詢分析 毛果楊（Populus trichocarpa）基因家族成員結(jié)構(gòu)分析：基因名稱，位置染色體，基因序列大小，編碼序列大小，外顯子和內(nèi)含子數(shù)，搜索探針等。

1.2.3 毛果楊A(yù)rgonaute基因家族物理化學(xué)性質(zhì)和亞細(xì)胞定位 主要使用在線軟件EXPASY Protparma（expasy網(wǎng)站）來分析AGO基因家族成員的理化特性。使用在線軟件Plant-mPLoc預(yù)測毛果楊（Populus trichocarpa）AGO基因家族成員的亞細(xì)胞定位。

1.2.4 motif結(jié)構(gòu)對比和系統(tǒng)發(fā)育樹建立 使用TBtools軟件對AGO基因家族成員進(jìn)行基序結(jié)構(gòu)分析;使用MEGA 5.0軟件為毛果楊（Populus trichocarpa）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）的AGO基因家族成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 AGO基因家族器官組織的基因表達(dá) 在Affymetrix網(wǎng)站上搜索AGO基因家族成員的探針，并通過BAR數(shù)據(jù)庫（bar.Utoronto）檢索成員的組織表達(dá)的相對量。運(yùn)用聚類熱圖軟件 Multiple Experiment Viewer繪制AGO基因家族組織表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛果楊A(yù)GO基因家族的結(jié)構(gòu) 經(jīng)過不斷的分析驗證，最終確定了13個毛果楊A(yù)GO基因家族成員（表1）。毛果楊A(yù)GO基因的基因序列長相差較大，其中最長的為 POPTR-0001 s22710 g基因，有2.15kbp，然而最小的為 POPTR-0008 s01100 g基因。AGO基因的編碼序列差異不大，最長的是POPTR-0012 s03410 g基因，長度為3189bp。而最短的也有2463bp，是 POPTR-0010 s09150 g基因。POPTR-0010 s17100 g、 POPTR-0012 s11920 g、POPTR-0015 s15780 g的外顯子數(shù)量只有3～4個，而其他 AGO家族成員的外顯子數(shù)量超過20個，表明這些基因家族成員的不同功能和不同作用模式由結(jié)構(gòu)差異顯示。

2.2 AGO基因家族成員的理化特性和亞細(xì)胞定位預(yù)測 預(yù)測并分析了毛果楊A(yù)GO蛋白的理化特性和亞細(xì)胞定位，如表2所示：毛果楊A(yù)GO蛋白的理化特性及亞細(xì)胞定位預(yù)測。分析結(jié)果顯示，毛果楊A(yù)GO基因家族13位成員的氨基酸序列數(shù)量都比較多，有820～1062個氨基酸。毛果楊A(yù)GO蛋白的等電點(diǎn)（PI）為8.91～9.45。毛果楊A(yù)GO蛋白的分子量在96689.19～117666.56Da，13位成員的分子量之間相差較小，相對比較平衡。毛果楊A(yù)GO蛋白的親水性為-0.33～-0.537。毛果楊A(yù)GO蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)，除了POPTR～0012 s11920g和 POPTR～0015 s15780 g蛋白穩(wěn)定指數(shù)小于40，其他AGO蛋白穩(wěn)定性指數(shù)均大于40，表現(xiàn)出不穩(wěn)定性。毛果楊A(yù)GO蛋白的脂溶性指數(shù)都比較大，平均都在73.53～85.88。亞細(xì)胞定位預(yù)測（表2）：毛果楊A(yù)GO蛋白主要分布在葉綠體和細(xì)胞核中。這個數(shù)據(jù)表明，毛果楊蛋白AGO蛋白與其行使的功能的位置保持一致。

2.3 毛果楊和擬南芥AGO蛋白motif分析 對毛果楊的AGO基因家族的13個成員進(jìn)行蛋白質(zhì)基序分析。毛果楊A(yù)GO基因家族的氨基酸數(shù)量都比較大，并且具有類似的motif結(jié)構(gòu)。

2.4 AGO蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹 對毛果楊A(yù)GO基因家族的13位成員和擬南芥AGO家族的10位成員的基因編碼進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。毛果楊和擬南芥的23個基因家族成員，它們可以分為3個類別，每個類別具有不同的支持率。A類中有9個成員，其中毛果楊A(yù)GO基因家族5個成員，擬南芥AGO基因家族4個成員。B組有8名成員，毛果楊有5名AGO基因家族成員，擬南芥AGO基因家族有3名成員;在C類中有6個成員，在擬南芥中有3個AGO基因家族成員。由于每個類都有來自毛果楊和擬南芥的AGO基因，因而可以從中推斷出毛果楊的祖先種類含有至少3個AGO基因，這也表明AGO基因起作用在植物發(fā)育中具有重要功能的基因家族在進(jìn)化上是保守的。A類中POPTR-0006s02680g和POPTR-0016s02480g，AGO8和AGO10，POPTR-0014s15760g和AGO6的基因座位;B類中POPTR-0006s12010g和POPTR-0009s00660g，POPTR-0012s03410g和AGO1，POPTR-0008s15860g和POPTR-0010s09150g的基因座分別是高度重復(fù)的，并且分別聚集在小分支上。在C類中，可以看出，C類的每1個小的分支上的基因座位都具有較高的重復(fù)性，由此可以推斷，在毛果楊物種分化后，基因重復(fù)事件就開始了。同時，所有AGO蛋白都有3個功能域，即：Piwi、PAZ、DUF1785。

2.5 毛果楊A(yù)GO基因表達(dá) 在Affy網(wǎng)站檢索到了11個AGO基因的探針集，而未檢測到POPTR_0010s09150g基因的相應(yīng)的探針集，POPTR_0006s02680g的探針集雖然檢測到了，但是沒有相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析。獲得的AGO家族基因在根，葉，幼葉，雌花，雄花，木質(zhì)部等中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)數(shù)據(jù)。根據(jù)AGO基因在不同組織部位的表達(dá)數(shù)據(jù)制作熱圖所示：AGO基因家族的幾乎所有成員都有不同的表達(dá)差異。大多數(shù)毛果楊A(yù)GO基因在成葉，雌花上的基因表達(dá)量很少，大部分毛果楊A(yù)GO基因在幼葉上的基因表達(dá)量相對較多，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織的表達(dá)量。通過仔細(xì)觀察，可以發(fā)現(xiàn)POPTR_0008s01100g基因在雌花和雄花上的基因表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織的基因表達(dá)量，這就說明，該基因的主要作用部位位于雌花和雄花。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論 植物AGO蛋白功能的鑒定主要在模式植物如擬南芥中進(jìn)行，取決于它所結(jié)合的sRNA是否參與子葉的分化，在植物病毒感染期間發(fā)育調(diào)節(jié)花器官形成，莖尖分生組織和RNAi調(diào)節(jié)[6]。目前，AGO家族的2個最近成員AGO1和AGO10研究最多，主要涉及莖尖分生組織的維持。而且通過RNAi機(jī)制調(diào)控LFY（LEAFY）、AP1（ APETALA1）和AG（AGAMOUS）基因的表達(dá)，它最終影響植物的分生決定，開花轉(zhuǎn)化和花器官的測定，以及 KNOX，AG和AP3對葉和花粉管的分化[7]。AGO1和AGO10還可以通過分別調(diào)控miR172和miR165/166以引起成花干細(xì)胞的終止[8]。雖然AGO1是miR168的靶基因，但最近的研究表明它通過miR168的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)在應(yīng)激反應(yīng)和信號傳導(dǎo)中起重要作用，而且這種作用機(jī)制是保守的。表達(dá)分析表明，AGO1廣泛存在于各種組織中，而AGO10僅位于分生組織，導(dǎo)管和側(cè)器官原基的近軸末端。此外，水稻中有19個AGO家族基因，主要在繁殖生長階段表達(dá)，特別是在穗期。其中6個基因能夠響應(yīng)激素處理，且大多數(shù)基因與DCL（Dicer-like）、DRB（Double-stranded RNA binding）參與RNA沉默的基因，例如 RDR（RNA依賴性 RNA聚合酶），在生長和非生物脅迫中共表達(dá)。番茄（Lycopersicum esculentum）中有15個SlAGO基因，其中大部分基因在番茄黃葉病毒感染和非生物脅迫中顯著增加[4]。SlAGO1蛋白和miR168在決定植物生長速率，發(fā)育階段變化，葉片上調(diào)，果實(shí)起始和擴(kuò)展以及其他發(fā)育階段中起重要作用。雖然AGO蛋白家族成員在模式植物中的作用和作用機(jī)制研究取得了很大進(jìn)展，但對木本植物AGO蛋白家族基因的研究卻很少。從PtAGO克隆PeAGO5a和PdAGO5b基因，編碼的氨基酸序列含有3個保守結(jié)構(gòu)域DUF1785，PAZ和Piwi。差異表達(dá)分析表明，它可能參與楊樹插條不定根發(fā)育的二次生長，是木本植物的重要特征[9]。最近的研究表明，AGO1和AGO10在不同位點(diǎn)通過miR165/166作用于莖尖分??生組織的分化[10]，木質(zhì)植物形成層的分化已經(jīng)通過miR165/166確認(rèn)，并且AGO蛋白家族的成員是否作用于該過程或者哪個家族成員作用于該過程，還需要進(jìn)一步的研究[11]。同時，該研究的結(jié)果表明AGO4b.1在木質(zhì)部高表達(dá)，但在其他組織中不表達(dá)。而AGO4可以通過RNA-directed DNA methylation（RdDM）途徑與Heterochromatic siRNAs作用調(diào)控DNA的甲基化，復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中組裝，然后通過細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核以發(fā)揮其功能。AGO4是否通過調(diào)節(jié)DNA甲基化途徑調(diào)節(jié)毛果楊木材的形成和發(fā)育需要進(jìn)一步研究。

3.2 結(jié)論 本研究獲得了PtAGO基因家族的結(jié)構(gòu)特征，13個基因家族成員主要分布在9條染色體上。染色體1，6，8，9，10，12，14，15和16的染色體高度重復(fù)，AGO基因的基因位點(diǎn)較高。所有的AGO蛋白都存在3個功能結(jié)構(gòu)域：Piwi、PAZ、DUF1785。同時，根據(jù)毛果楊A(yù)GO基因在不同的組織部位的表達(dá)數(shù)據(jù)分析，推測出毛果楊A(yù)GO基因家族不同成員在不同組織中的基因表達(dá)量，從而得到該基因的作用部位主要在根、幼葉和木質(zhì)部上。

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（責(zé)編：張宏民）