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苯并芘和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯復(fù)合暴露對稀有鮈鯽的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)研究

2019-04-16 10:02付娟娟郭勇勇韓建楊麗華周炳升李云峰倪朝輝
生態(tài)毒理學(xué)報(bào) 2019年6期
關(guān)鍵詞:雌二醇睪酮毒性

付娟娟,郭勇勇,韓建,楊麗華,周炳升,李云峰,倪朝輝

1. 中國科學(xué)院水生生物研究所,淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430072 2. 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049 3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所,武漢 430223

長江是亞洲第一長河,也是中國水量最豐富的河流,其水環(huán)境與中國人們生活息息相關(guān)。長期調(diào)查表明,長江水環(huán)境中存在多種有機(jī)污染物,例如,鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters, PAEs)、多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)和多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)等。

鄰苯二甲酸酯(PAEs),又稱酞酸酯,廣泛應(yīng)用于塑料制品、化妝品、油漆、食品包裝、兒童玩具、潤滑劑和農(nóng)藥等制造行業(yè)中。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,PAEs的產(chǎn)量和使用量不斷增加,據(jù)估計(jì)全球PAEs的總產(chǎn)量已超過800萬t[1],而中國是PAEs的最大進(jìn)口國,到2010年,中國的PAEs使用量高達(dá)136萬t,到2015年,中國PAEs年均使用量增長了約7.7%[2]。在酞酸酯中,鄰苯二甲酸二乙基己酯(di-(2-ethylhexyl)phthalate, DEHP)是目前使用最為廣泛的一種典型的增塑劑,在中國,DEHP年產(chǎn)量占PAEs總產(chǎn)量的80%以上[3],因此是酞酸酯中最主要的增塑劑。目前,DEHP已在全球的非生物介質(zhì)中以及野生動物和人類的血液、尿液中都不同程度的檢出,是分布非常廣泛的有機(jī)污染物,大量DEHP的毒性研究結(jié)果表明,DEHP具有生殖毒性、胚胎毒性、肝臟毒性、免疫毒性及致癌性等多種毒性[4-6]。

多環(huán)芳烴(PAHs)是一類廣泛存在于環(huán)境中的有機(jī)污染物,主要是石油、煤等化石燃料和木材、煙草等有機(jī)物在不完全燃燒過程中產(chǎn)生的[7];另一方面,在森林火災(zāi)和火山爆發(fā)等自然現(xiàn)象中也可產(chǎn)生PAHs。PAHs可以通過燃料排放和石油泄漏等途徑直接進(jìn)入水體中,也可以通過大氣循環(huán)、遷移轉(zhuǎn)化等間接途徑污染水體。中國水環(huán)境中PAHs污染狀況較為嚴(yán)重,在中國長江流域、珠江流域以及遼河流域等水體和沉積物中均檢出不同含量的PAHs[8-9],并且PAHs總量最高達(dá)到12.9 μg·L-1[10]。苯并芘(benzo(a)pyrene, BaP)是PAHs中最具代表性的一種污染物,大量流行病學(xué)調(diào)查及可疑危險(xiǎn)因素分析表明,BaP不僅是強(qiáng)致癌物,還是強(qiáng)致畸、致突變劑和內(nèi)分泌干擾物。其不僅對呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等有損傷作用,而且與不良妊娠結(jié)局的發(fā)生密切相關(guān)[11]。據(jù)諸多研究報(bào)道,BaP具有抗雌激素活性,會嚴(yán)重影響哺乳動物、水生動物等的生殖系統(tǒng)和繁殖[12]。

在實(shí)際水環(huán)境中,污染物并非單一存在,所以單一物質(zhì)的毒性研究已經(jīng)不能完全反映其在環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn)。2種或多種物質(zhì)混合后,常會發(fā)生毒性的改變,稱為毒性的聯(lián)合作用。因而聯(lián)合毒性效應(yīng)能夠更加準(zhǔn)確、真實(shí)地反應(yīng)污染物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。聯(lián)合作用的類型,一般分為協(xié)同作用、加和作用、獨(dú)立作用和拮抗作用。當(dāng)毒物聯(lián)合作用的毒性大于其中各毒物成分單獨(dú)作用毒性的總和時(shí)稱協(xié)同作用;多種毒物同時(shí)存在時(shí)的毒作用為各毒物分別作用時(shí)毒作用的總和時(shí)稱加和作用;而獨(dú)立作用的毒性低于相加作用,但高于其中單項(xiàng)毒物毒性;拮抗作用指的是毒物聯(lián)合作用的毒性小于其中各毒物成分單獨(dú)作用毒性的總和。對于預(yù)測聯(lián)合毒性分析的數(shù)學(xué)模型,應(yīng)用最廣泛的有濃度加和模型(concentration addition, CA)和效應(yīng)加和模型(response addition, RA)。其中,CA是混合物風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)中使用最多的方法,特別是在混合物毒性未知的情況下;而RA是混合物每組分效應(yīng)的加和,混合物中各組分被認(rèn)為彼此獨(dú)立作用且不影響其他物質(zhì)的毒性,適用于獨(dú)立聯(lián)合作用。先前的研究結(jié)果顯示,三峽庫區(qū)的PAEs和PAHs的范圍分別為1.96~7.81和0.23~0.99 μg·L-1,是最主要的2類有機(jī)污染物[13-15]。筆者先前研究了PAHs的代表物BaP對稀有鮈鯽的內(nèi)分泌干擾效應(yīng),結(jié)果表明,低劑量BaP暴露不會影響魚體內(nèi)激素和基因的水平[16],但是對于長江水體中的多種有毒物質(zhì)同時(shí)存在時(shí)對珍稀魚類的影響還不清楚?;赑AHs和PAEs在長江上游水體中共同存在的客觀事實(shí),二者聯(lián)合暴露更接近于上游珍稀特有魚類的真實(shí)生存環(huán)境。因此,研究二者聯(lián)合暴露的毒理學(xué)效應(yīng)非常必要。

在毒理學(xué)研究中,濃度的設(shè)置是正式實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵,濃度范圍一般介于無效應(yīng)濃度和最大耐受濃度之間。但在不同的試驗(yàn)中濃度梯度的設(shè)置也存在著一些差別,例如在急性毒性試驗(yàn)中,污染物濃度水平的設(shè)置一般按照等對數(shù)間距設(shè)置;而在亞慢性試驗(yàn)中,污染物濃度水平的設(shè)置一般按幾何級數(shù)設(shè)置。此外,在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的研究中,低濃度的設(shè)置以實(shí)際環(huán)境劑量為參考,然后按幾何級數(shù)遞增。本實(shí)驗(yàn)選擇了長江水域中2種典型的代表污染物DEHP和BaP,以實(shí)際環(huán)境中BaP和DEHP在長江上游中的含量為依據(jù),各選取2個(gè)濃度來探討2種污染物共存的情況下對稀有鮈鯽的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。筆者檢測了稀有鮈鯽的形態(tài)學(xué)指標(biāo),血清中性激素水平,以及下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal, HPG)相關(guān)基因和肝臟中卵黃蛋白原(vitellogenin, VTG)基因的轉(zhuǎn)錄水平,以評價(jià)BaP和DEHP對稀有鮈鯽潛在的內(nèi)分泌干擾效應(yīng),為預(yù)測多種污染物共存條件下對長江上游魚類的潛在影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與試劑

苯并芘(BaP,CAS:50-32-8)和鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP,CAS:117-81-7)購自美國AccuStandard公司,助溶劑為二甲基亞砜(DMSO),購自美國Amresco公司。內(nèi)標(biāo)化合物氘代苯并芘(d12-BaP)和氘代鄰苯二甲酸二乙基己酯(d4-DEHP)分別購自美國Supelco和AccuStandard公司。RNA提取試劑(RNAiso Plus reagent)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimerScript RTreagent Kit)購自中國Takara公司。熒光定量試劑盒(SYBR Green PCR Kit)購自日本Toyobo公司。睪酮和雌二醇酶聯(lián)免疫試劑盒(Testosterone EIA Kit和Estradiol EIA Kit)購自美國Cayman公司。其他所有試劑均為分析純。

1.2 稀有鮈鯽的飼養(yǎng)和暴露實(shí)驗(yàn)

將稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)飼養(yǎng)在經(jīng)活性炭過濾且充分曝氣的自來水中,光暗周期為16 h∶8 h,水溫維持在(25±1) ℃,飼養(yǎng)期間每天投喂餌料2次,餌料為小顆粒商品餌料和剛孵化的豐年蟲幼蟲。暴露實(shí)驗(yàn)開始前,將性成熟的稀有鮈鯽(7月齡)以半靜態(tài)條件在裝有20 L水的缸中馴養(yǎng)2周。每個(gè)缸中放置8條雌魚和8條雄魚,每天清除多余餌料和排泄物。適應(yīng)期過后,稀有鮈鯽暴露于0、BaP(0.1、1 μg·L-1)、DEHP(10、100 μg·L-1)和BaP+DEHP((0.1+10)、(1+100) μg·L-1)的暴露液中28 d,暴露結(jié)束前一天下午停止喂食,使實(shí)驗(yàn)魚空腹。暴露組和溶劑對照組中DMSO的終濃度為0.001%(體積比)。每個(gè)濃度包括3個(gè)平行缸,暴露期間每天更換1/2的暴露液。28 d后,用0.03%的MS-222將魚麻醉,并用濾紙吸干,稱量并記錄體長和體重,斷尾采血用于激素測定。準(zhǔn)確分離腦、肝臟和性腺并稱重,于液氮中瞬間冷凍,保存于-80 ℃中待測。各形態(tài)學(xué)指標(biāo)的計(jì)算方法如下:

K=m/L3×100%

(1)

BSI=mB/m×100%

(2)

GSI=mG/m×100%

(3)

HSI=mH/m×100%

(4)

式中:K為條件因子,m為體重(g),L為體長(cm),BSI為腦指數(shù),mB為腦質(zhì)量(g),GSI為性腺指數(shù),mG為性腺質(zhì)量,HSI為肝臟指數(shù),mH為肝臟質(zhì)量(g)。

1.3 化學(xué)分析

在暴露的第3天和第7天,分別從暴露缸中取換水后水樣200 mL,保存于干凈的玻璃瓶中,經(jīng)0.7 μm玻璃纖維濾膜過濾后收集過濾液,加入對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)化合物。水樣中BaP及DEHP的抽提方法和分析方法參考之前的文獻(xiàn)[17-18]。DEHP用SILICA/PAS玻璃混合型SPE小柱富集(SPE小柱預(yù)先用二氯甲烷、乙腈和超純水依次活化),流速控制在6~8 mL·min-1。水樣富集完畢,真空下將柱干燥30 min,然后用乙腈洗脫,洗脫液一并收集到干凈的玻璃瓶中,高純氮?dú)饩従彺蹈?,最后?.1 mL丙酮溶解目標(biāo)化合物,4 ℃保存待測。BaP用C18填料的SPE小柱富集(SPE小柱預(yù)先用二氯甲烷、甲醇和超純水活化),待測水樣以5 mL·min-1的流速流過已活化的C18小柱。水樣富集完畢真空抽濾30 min使柱干燥。然后用二氯甲烷洗脫,洗脫液一并收集到干凈的玻璃瓶中,高純氮?dú)饩従彺蹈?,最后?.1 mL乙腈溶解目標(biāo)化合物,4 ℃保存待測。本研究利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890A-5975C)分析了對照組和各處理組暴露水體中BaP和DEHP的實(shí)際濃度。用程序空白和空白加標(biāo)來進(jìn)行質(zhì)量控制,根據(jù)d4-DEHP和d12-BaP測定加標(biāo)回收率分別在89%~106%和93%~115%之間。

1.4 性激素的抽提與測定

暴露結(jié)束后,MS-222(0.03%)麻醉實(shí)驗(yàn)魚,斷尾采血。每2條魚的血混合一起作為一個(gè)平行樣,每個(gè)濃度雌雄魚各4個(gè)平行。在4 ℃、7 000 r·min-1條件下離心5 min,取上清10 μL用于性激素的檢測。激素抽提法參照Guo等[17]的方法。即每個(gè)樣品(10 μL血清)中加入390 μL Milli-Q水,渦旋混勻,向其中加入2 mL乙醚,混勻器混勻,于4 ℃、5 000 r·min-1下離心10 min,取上清。再用2 mL乙醚按上述方法抽提一次,將2次抽提后的上清液集中于一個(gè)干凈離心管中,用氮?dú)獯蹈珊蟊4嬗?80 ℃。所得樣品用試劑盒中120 μL EIA buffer溶解,按照Cayman Chemical Company公司的睪酮和雌二醇試劑盒說明書檢測性激素含量,其中睪酮的檢測限為6 pg·mL-1,雌二醇的檢測限為19 pg·mL-1。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

雌雄魚各不同組織(每個(gè)平行由2條魚的樣品合并而成)總RNA提取、純化、定量及cDNA合成法參照Wang等[19]的方法。為避免基因組DNA的污染,初提取物的總RNA用RNase和DNaseI進(jìn)行消化并純化。用分光光度計(jì)測定樣品在260和280 nm下的吸光值,同時(shí)用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測RNA的濃度,取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,用SYBR Green I染料法對目標(biāo)基因進(jìn)行定量檢測(ABI 7300, Applied Biosystem, USA)。反應(yīng)體系為20 μL,其中包括SYBR Green PCR master mix (Toyobo, Japan) 10 μL、ROX 0.4 μL、5 μmol·L-1正義和反義引物各0.5 μL及cDNA 1 μL和7.6 μL ddH2O。實(shí)時(shí)定量PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s,58 ℃復(fù)性20 s,72 ℃延伸1 min,40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因選擇β-actin,內(nèi)參及目標(biāo)基因引物序列通過軟件Primer 5 (http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/)設(shè)計(jì),引物序列見表1。所有樣品的定量檢測至少重復(fù)3次,每次3個(gè)平行。以2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因mRNA的相對表達(dá)量[20]。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。通過Kolmogorov-Smirnov方法檢測數(shù)據(jù)的正態(tài)性,通過Levene’s檢驗(yàn)方法分析數(shù)據(jù)的方差同質(zhì)性,數(shù)據(jù)滿足方差同質(zhì)性,使用SPSS 13.0軟件(SPSS, Chicago, IL, USA)通過Dunnett’s檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,當(dāng)P<0.05時(shí),即表示有顯著性差異。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR基因引物Table 1 Primer sequences for the quantitative real-time polymerase chain reaction assays used in this study

2 結(jié)果(Results)

2.1 暴露水中BaP和DEHP的實(shí)際含量

在2次收集(第3天和第7天)的水樣中,BaP和DEHP的含量無明顯差異。暴露水中BaP和DEHP的實(shí)際濃度如表2所示。為了方便起見,后面仍用名義濃度表示。

2.2 形態(tài)學(xué)指標(biāo)

稀有鮈鯽的形態(tài)學(xué)指標(biāo)變化如表3所示。在雌性實(shí)驗(yàn)組中,BaP和DEHP單獨(dú)暴露對稀有鮈鯽的各形態(tài)學(xué)指標(biāo)均未有明顯影響,在BaP和DEHP復(fù)合暴露中,均顯著增加了雌魚的腦指數(shù)(P<0.05);在雄性組中,只有在1 μg·L-1BaP和100 μg·L-1DEHP顯著增加了稀有鮈鯽的肝臟指數(shù)(P<0.05)。

2.3 血漿中性激素水平

BaP和DEHP單獨(dú)暴露下,雌性和雄性稀有鮈鯽的性激素水平均未有顯著性變化(圖1)。在雌魚體內(nèi),1 μg·L-1BaP+100 μg·L-1DEHP復(fù)合暴露組血漿中睪酮(T)含量與對照組及各自單獨(dú)處理組相比顯著性升高(圖1(a)),但血漿中雌二醇(E2)含量與對照組相比顯著性降低(圖1(b))。在復(fù)合暴露組中,雄性稀有鮈鯽血漿中的T和E2的水平均未有顯著性改變(圖1(c), (d))。T/E2是性激素異常的敏感指示指標(biāo),在雌魚的1 μg·L-1BaP+100 μg·L-1DEHP組中,血漿中T/E2與對照組和各自的單獨(dú)處理組相比均顯著性升高(圖1(e)),而雄魚的各濃度組與對照組相比都無顯著性差異(圖1(f))。

2.4 基因表達(dá)

對稀有鮈鯽HPG軸和肝臟中相關(guān)基因進(jìn)行了檢測,結(jié)果表明,與對照組相比,雌魚中l(wèi)h和17β-hsd基因表達(dá)量在BaP和DEHP單獨(dú)暴露時(shí)均無顯著差異(表4),單獨(dú)100 μg·L-1DEHP處理顯著下調(diào)了cyp19a基因的表達(dá)(表4),但顯著升高了fsh和cyp17的表達(dá)量(表4);與對照組相比,復(fù)合暴露的1 μg·L-1BaP+100 μg·L-1DEHP組中,fsh、vtg、cyp17和17β-hsd基因表達(dá)量顯著上調(diào)了1.62、2.73、1.96和1.28倍(表4),cyp19a則顯著下調(diào)了-1.56倍(表4)。

雄性稀有鮈鯽相關(guān)基因中,fsh、cyp17、17β-hsd和cyp19a的表達(dá)量在BaP、DEHP單獨(dú)暴露以及二者復(fù)合暴露下均無顯著性差異(表5);lh基因的表達(dá)量在BaP和DEHP單獨(dú)暴露下均無顯著性改變,而在二者復(fù)合暴露高濃度組中,lh的表達(dá)量顯著性下調(diào)了-1.52倍(表5),vtg基因的表達(dá)量在100 μg·L-1DEHP單獨(dú)處理組和1 μg·L-1BaP+100 μg·L-1DEHP復(fù)合處理組中顯著性上調(diào)了1.48倍和1.81倍(表5)。

3 討論(Discussion)

之前大多數(shù)研究集中在單一化合物對魚類的毒理學(xué)效應(yīng),但在實(shí)際水環(huán)境中,化合物并不是單一存在,因而單一物質(zhì)評價(jià)不能完全反映其在環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn)。在本研究中,筆者以中國特有模式魚類稀有鮈鯽為研究對象,評價(jià)了長江上游水域主要典型污染物BaP和DEHP共同存在時(shí)的生殖內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)檢測了魚體各形態(tài)學(xué)指標(biāo)、體內(nèi)性激素水平和HPG軸及肝臟中相關(guān)基因的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,BaP、DEHP單獨(dú)暴露時(shí)對稀有鮈鯽性激素含量和基因表達(dá)基本上無顯著影響,但兩者復(fù)合暴露情況下,在高濃度復(fù)合暴露組顯著改變了稀有鮈鯽體內(nèi)性激素的水平及相關(guān)基因的表達(dá),說明BaP和DEHP共同存在的情況下,顯著增強(qiáng)了它們各自的毒性效應(yīng),表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。

表2 利用GC-MS檢測各單獨(dú)或復(fù)合暴露組中苯并芘(BaP)和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)的濃度Table 2 The measured concentrations of benzo(a)pyrene (BaP) and di-(2-ethylhexyl)-phthalate (DEHP) in each single or co-exposure group by GC-MS analysis

注:實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示;—表示沒有檢測,LOD為檢測限。
Note: Data are expressed as mean±SEM; — means not detected; LOD means limits of detection.

表3 稀有鮈鯽暴露于不同濃度BaP、DEHP和BaP+DEHP中28 d后體質(zhì)系數(shù)的變化Table 3 Somatic indices of rare minnow after exposure to BaP, DEHP and BaP+DEHP

注:實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,每個(gè)濃度24條魚,*表示P<0.05,實(shí)驗(yàn)組與對照組相比,差異顯著。
Note: Data are expressed as mean±SEM; there are 24 fish in each exposure concentration; *P<0.05 indicates the statistically significant differences compared to the control groups.

圖1 稀有鮈鯽暴露于不同濃度BaP、DEHP和BaP+DEHP中28 d血漿中睪酮(T)、雌二醇(E2)水平和T/E2比值的變化注:測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,每個(gè)濃度4個(gè)平行樣,平均數(shù)后上標(biāo)不同字母表示處理組間差異顯著(P<0.05)。Fig. 1 Effects on levels of serum testosterone (T), 17β-estradiol (E2) and T/E2 ratio in rare minnows after exposure to BaP, DEHP and BaP+DEHPNote: Data are expressed as mean±SEM; there are 4 replicates in each exposure concentration; different letters indicate the significant difference among the exposure groups (P<0.05).

表4 稀有鮈鯽暴露于不同濃度BaP、DEHP和BaP+DEHP 28 d后雌魚HPG軸和肝臟中相關(guān)基因的表達(dá)水平Table 4 mRNA expression of related genes in HPG axis and liver of female rare minnows after exposure to BaP, DEHP and BaP+DEHP for 28 d

注:實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,*表示P<0.05。
Note: Data are expressed as mean±SEM; *P<0.05 indicate the statistically significant differences.

表5 稀有鮈鯽暴露于不同濃度BaP、DEHP和BaP+DEHP 28 d后雄魚HPG軸和肝臟中相關(guān)基因的表達(dá)水平Table 5 mRNA expression of related genes in HPG axis and liver of male rare minnows after exposure to BaP, DEHP and BaP+DEHP for 28 d

注:實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,*表示P<0.05。
Note: Data are expressed as mean±SEM; *P<0.05 indicates the statistically significant differences.

在毒理學(xué)研究中,性激素水平變化是評價(jià)生殖內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中,稀有鮈鯽經(jīng)過28 d暴露后,1 μg·L-1BaP+100 μg·L-1DEHP暴露組的雌魚血漿中睪酮含量顯著升高但雌二醇含量顯著降低,表現(xiàn)出性別特異性和濃度依賴關(guān)系。以往研究表明,BaP和DEHP均是環(huán)境中普遍存在的內(nèi)分泌干擾物,且二者對哺乳動物、魚類等生物均具有生殖內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[11,21]。有研究人員用50 mg·kg-1的BaP注射性成熟的虹鱒(Oncorhynchusmykiss),發(fā)現(xiàn)無論雌魚還是雄魚,血漿中雌二醇和睪酮含量均顯著性降低[22]。同樣,石首魚(Micropogoniasundulates)經(jīng)腹腔注射BaP后,血漿中睪酮和雌二醇含量也顯著受到抑制[23]。另外,筆者之前的研究結(jié)果表明,將稀有鮈鯽暴露于不同濃度的BaP 28 d后,3 μg·L-1BaP暴露后的雌雄魚體內(nèi)的雌二醇含量顯著性降低[16]。雖然本實(shí)驗(yàn)中BaP單獨(dú)暴露對稀有鮈鯽體內(nèi)性激素水平?jīng)]有影響,但是這有可能是BaP暴露濃度較低導(dǎo)致的,這也與筆者之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。對于DEHP的研究指出,將成年稀有鮈鯽暴露于環(huán)境相關(guān)劑量的DEHP(3.6、12.8、39.4和117.6 μg·L-1)中21 d后,在雌魚中,睪酮含量升高,雌二醇含量降低,T/E2比例增加[19]。除此之外,筆者將成年稀有鮈鯽暴露于環(huán)境相關(guān)劑量的DEHP(4.2、13.3和40.8 μg·L-1)中6個(gè)月,結(jié)果顯示,在雌魚體內(nèi),雌二醇和睪酮的含量均顯著性降低[17]。此外,將雄性黑頭呆魚(Pimephalespromelas)暴露于環(huán)境相關(guān)劑量(12 μg·L-1)的DEHP 28 d,明顯降低了黑頭呆魚體內(nèi)E2的水平[24]。以上這些結(jié)果說明,DEHP暴露打破了動物體內(nèi)激素系統(tǒng)的平衡,產(chǎn)生了干擾效應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中,只有BaP和DEHP同時(shí)存在時(shí),高濃度組的雌魚體內(nèi)睪酮和雌二醇含量才會顯著性改變,表明在一定濃度范圍內(nèi),二者同時(shí)作用時(shí)會增強(qiáng)對稀有鮈鯽的生殖內(nèi)分泌干擾效應(yīng),表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。

在類固醇激素合成的過程中,一系列激素(如FSH、LH)和酶類(CYP17、17β-HSD和CYP19a等)發(fā)揮著重要作用[25]。魚類的FSH主要是刺激性腺分泌雌二醇和睪酮等性類固醇激素,LH與排精和排卵有關(guān)[26]。而類固醇合成酶對類固醇激素的產(chǎn)生同樣是至關(guān)重要的,編碼這些合成酶的基因上調(diào)或者下調(diào),會導(dǎo)致類固醇激素(如T、E2)合成效率的升高或降低。本實(shí)驗(yàn)1 μg·L-1BaP+100 μg·L-1DEHP中雌魚fsh表達(dá)量顯著上調(diào)可能是雌二醇顯著降低的一種負(fù)反饋機(jī)制。此外,在本實(shí)驗(yàn)中還觀察到1 μg·L-1BaP+100 μg·L-1DEHP組中雌魚性腺中的cyp17和17β-hsd表達(dá)量顯著上調(diào),而cyp19a表達(dá)量則受到顯著性抑制。在魚類類固醇激素合成的過程中,cyp17編碼的蛋白催化黃體酮轉(zhuǎn)化為17α-羥基黃體酮,繼續(xù)催化轉(zhuǎn)化為雄烷二酮,進(jìn)而通過17β-HSD轉(zhuǎn)化為睪酮,而cyp19a編碼的芳香化酶可以催化睪酮轉(zhuǎn)化為雌二醇[25]。因此,cyp19a基因表達(dá)量受到抑制可能會抑制睪酮向雌二醇的轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致血漿中睪酮水平的升高和雌二醇水平的降低,而cyp17和17β-hsd基因表達(dá)的上調(diào)可能是機(jī)體對于雌二醇下降的一種補(bǔ)償機(jī)制。先前有研究報(bào)道稱,DEHP可通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)的表達(dá)來抑制芳香化酶的活性,從而抑制E2的產(chǎn)生[26]。但也有研究發(fā)現(xiàn),DEHP和利谷隆復(fù)合暴露導(dǎo)致的雄性黑頭呆魚血清中睪酮含量降低并不是因?yàn)橐种屏伺c類固醇生成相關(guān)的基因,也不是由于激活PPARs基因的表達(dá),而是升高了類固醇激素分解代謝的水平如升高了肝臟中CYP3A4以及睪丸中磺基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平[24]。筆者先前的研究觀察到稀有鮈鯽暴露DEHP 21 d后,雌魚血漿中雌二醇含量降低,性腺中cyp17的表達(dá)量上調(diào),而cyp19a的表達(dá)量下調(diào)[19]。同樣,在BaP單獨(dú)暴露時(shí),也發(fā)現(xiàn)雌性斑馬魚(Daniorerio)性腺中cyp19a基因表達(dá)顯著下調(diào)的現(xiàn)象,并且肝臟中vtg表達(dá)量也顯著受到抑制[27]。以上結(jié)果說明,DEHP單獨(dú)或與其他化合物共存的情況下,可能通過不同的作用模式對魚類產(chǎn)生不良影響。在本研究中,BaP和DEHP復(fù)合暴露的情況下,可能通過抑制芳香化酶的活性導(dǎo)致T向E2轉(zhuǎn)化效率的降低,從而導(dǎo)致T的升高和E2的下降,E2的下降通過機(jī)體自身的負(fù)反饋機(jī)制上調(diào)了fsh基因的表達(dá),但具體的作用機(jī)理需要后續(xù)進(jìn)一步的研究。在魚類中,卵黃蛋白原(VTG)是卵子發(fā)生,卵子成熟及卵黃合成中必不可少的營養(yǎng)物質(zhì),是雌激素效應(yīng)敏感的生物標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)中觀察到的雌魚雌二醇含量降低而vtg基因表達(dá)量卻顯著升高的現(xiàn)象在之前的實(shí)驗(yàn)中也有觀察到,例如,在長期低劑量DEHP暴露后,稀有鮈鯽雌魚血漿中雌二醇含量下降,而vtg表達(dá)量上調(diào),猜測這可能是由于這些具有雌激素活性的化合物直接作用于雌激素受體,從而誘導(dǎo)vtg基因表達(dá)[17]。而在本次實(shí)驗(yàn)中,觀察到除了高濃度的DEHP組和高濃度的復(fù)合暴露組中l(wèi)h和vtg表達(dá)量改變之外,所有濃度組對雄性稀有鮈鯽基本無顯著影響。

本研究得出以下結(jié)論:較高濃度的BaP和DEHP同時(shí)存在時(shí),會改變雌性稀有鮈鯽血漿中睪酮和雌二醇含量,同時(shí)引起了HPG軸和肝臟中相關(guān)基因表達(dá)量的改變,而低劑量的復(fù)合暴露以及單獨(dú)的BaP、DEHP處理并沒有引起激素或相關(guān)基因的改變。這一結(jié)果說明,BaP和DEHP共同存在時(shí),會改變它們各自的毒性,表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng);此外,由于長江上游水體中BaP和DEHP含量遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)觀察到的效應(yīng)濃度,筆者推測,三峽庫區(qū)上游水體中的BaP和DEHP并不會對該區(qū)域的魚類產(chǎn)生生殖內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。

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