李小琴 張鳳良 楊 湉 趙 祺 毛常麗 吳 裕

( 云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南 西雙版納 666100)

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）原產(chǎn)南美亞馬遜河流域的熱帶雨林中，是典型的熱帶喬木樹種。中國植膠區(qū)地處熱帶北緣，屬于非傳統(tǒng)植膠區(qū)，低溫是限制該區(qū)域橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素。云南植膠區(qū)由于其緯度更偏北，海拔更高，冬季熱量不足，在植膠歷史上，已經(jīng)出現(xiàn)過7次比較重的寒害，其中1970—1976年，就出現(xiàn)了3次，且有2次災(zāi)害最重[1-4]。橡膠樹的生長（生產(chǎn)）周期長達(dá)30 a以上，研究表明，云南植膠區(qū)每間隔10～15 a會出現(xiàn)一次寒害，寒害的出現(xiàn)呈現(xiàn)周期性。為此，篩選培育抗寒高產(chǎn)的橡膠樹品種成為了云南天然橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要任務(wù)。

低溫能夠引起橡膠樹細(xì)胞結(jié)構(gòu)、原生質(zhì)膠體特性、水分狀況、細(xì)胞滲透壓、光合作用、呼吸作用、物質(zhì)代謝和保護酶系統(tǒng)等發(fā)生一系列改變，最終影響植株的生長發(fā)育及膠乳合成[5]。目前，橡膠樹抗寒種質(zhì)篩選的方法主要有抗寒前哨梯度苗木系比鑒定法、自然低溫鑒定法及人工模擬低溫鑒定法等，鑒定指標(biāo)包括形態(tài)、生理生化及分子細(xì)胞等[6-13]。橡膠樹抗寒性鑒定多集中在對品種及優(yōu)良無性系之間的比較，根據(jù)以往的研究可知，生長勢較好、速生的品種往往抗寒性都不弱，如云研77-2、IAN873、熱墾525、熱墾628、云研75-1、RRIM524等[14-18]，而就橡膠樹生長與抗寒性之間關(guān)系的研究較少。本研究選擇生長量有所差異的12份種質(zhì)資源進行人工模擬低溫寒害處理，測定其生理生化指標(biāo)，利用隸屬函數(shù)對抗寒性進行綜合評價，結(jié)合生長量進行相關(guān)性分析，以期為橡膠樹大規(guī)模種質(zhì)資源的抗寒性鑒定提供一個新的思路，也為橡膠樹抗寒育種選擇優(yōu)良材料。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

選取保存于云南省熱帶作物科學(xué)研究所“農(nóng)業(yè)部景洪橡膠樹種質(zhì)資源圃”內(nèi)的部分橡膠樹野生種質(zhì)資源，2016年采集芽條，以GT1開放授粉實生苗為砧木繁殖成無性系，芽接成活后，于2017年3月鋸桿，按株行距1 m×1 m育苗保留，苗圃地按照常規(guī)育苗管理，苗木生長良好。根據(jù)苗期生長量，選擇其中12份種質(zhì)資源進行抗寒生理測定，編號為1～12號。

2018年1月15日，每個無性系隨機選取4株長勢均勻的植株，剪下從上而下第2蓬葉的枝條，隨即放入冷藏取樣箱內(nèi)，帶回實驗室。依次用自來水和蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干水分，再將每根枝條剪成均勻的3段，同一無性系隨機分為4組，每組3段，用塑封袋包好，并做好標(biāo)記。用可調(diào)溫冰柜設(shè)置4個溫度梯度：4（對照）、0、-2 ℃和-4 ℃，將枝條分別放于設(shè)置好溫度的冰柜進行低溫處理，持續(xù)12 h后，取出放至室溫再進行樣品制備。

1.2 測定方法

相對電導(dǎo)率的測定：將低溫處理后的枝條用濾紙吸干水分，避開芽眼，準(zhǔn)確裁取1 cm×1 cm的小方塊枝條韌皮部，同一低溫處理同一無性系對3段枝條混合取樣共裁取6片，每2片放入一個試管中，加入雙重蒸餾水20 mL，混合均勻，設(shè)3次重復(fù)，室溫放置24 h，期間搖勻數(shù)次。用SG3-ELK型便攜式電導(dǎo)率儀先測出初始電導(dǎo)值（C1），再蓋上試管塞，沸水浴30 min，取出冷卻至室溫后，再測出終電導(dǎo)值（C2）。以相對電導(dǎo)率表示細(xì)胞膜透性大小，相對電導(dǎo)率按以下公式進行計算：

生理生化指標(biāo)測定方法[19]：丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法；游離脯氨酸（Pro）含量采用酸性茚三酮染色法；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法；可溶性糖含量采用蒽酮比色法。各指標(biāo)均采用枝條韌皮部（鮮質(zhì)量）進行測定，使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒進行測定及相關(guān)含量計算。

徑圍測量方法：用軟尺于采樣前對其1年生苗木1.0 m高處的粗度進行測量，每個橡膠樹無性系隨機測量50株，求其平均值。

1.3 分析方法

采用Excel 2003對數(shù)據(jù)進行整理作圖，用SPSS23.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析?？购缘木C合評價采用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)方法進行計算，隸屬函數(shù)值的計算方法如下[20]：

如果某一指標(biāo)與抗寒性為負(fù)相關(guān)，用反隸屬函數(shù)計算器抗寒隸屬函數(shù)值，計算方法為：

其中：Zij為第i個無性系第j個測定指標(biāo)的抗寒隸屬函數(shù)值；Xij為第i個無性系第j個指標(biāo)的測定值；Ximax和Ximin分別為全部無性系第j項指標(biāo)的最大值和最小值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫脅迫對相對電導(dǎo)率的影響

相對電導(dǎo)率是反映植物組織受凍后細(xì)胞原生質(zhì)膜透性大小的重要指標(biāo)，以相對電導(dǎo)率表示植物在低溫傷害下細(xì)胞質(zhì)膜透性變化是植物抗寒性鑒定常用的方法[21-22]。

經(jīng)不同低溫脅迫后，12個橡膠樹無性系枝條的相對電導(dǎo)率變化情況見圖1，0 ℃處理與對照4 ℃相比，變化最小，增幅最小的為1號和10號，增幅僅1%；增幅最大的為4號，增幅為39%。相對電導(dǎo)率0 ℃均值（39.27%）與4 ℃（34.02%）相比總體增幅為15%，說明0 ℃低溫對多數(shù)橡膠樹枝條組織傷害較小，細(xì)胞膜透性變化小。在-2 ℃時，部分無性系相對電導(dǎo)率上升明顯，超過50%有3個號，包括4號（61.38%）、12號（57.52%）和10號（53.14%）；而小于40%的有1號、3號和6號，表現(xiàn)出較強的耐低溫能力。到-4 ℃低溫時，各無性系與對照（4 ℃）相比相對電導(dǎo)率出現(xiàn)最高增幅且均已超過50%，總體均值已達(dá)68.25%，說明-4 ℃低溫對橡膠樹枝條組織已經(jīng)造成嚴(yán)重傷害。從整個變化趨勢可以看出橡膠樹枝條對-2～-4 ℃范圍的低溫極度敏感，多數(shù)都表現(xiàn)出對此低溫的不耐受性。

圖1 不同低溫脅迫下相對電導(dǎo)率的變化趨勢Fig. 1 The changing trend of relative electric conductivity under different low temperature stress

2.2 不同低溫脅迫對丙二醛含量的影響

橡膠樹各無性系枝條經(jīng)不同低溫脅迫后丙二醛含量的變化如圖2，各無性系丙二醛含量均表現(xiàn)為“先升高后降低”的變化趨勢。0 ℃時，與4 ℃對照相比總體增長較慢，但各無性系間差異較大，增幅在5%～37%之間，MDA含量變幅為9.03～10.58 nmol/g。所有無性系MDA含量的最大值都出現(xiàn)在-2 ℃，其中6號MDA含量最高，為12.69 nmol/g，且增幅也最大，比對照增長64%，而2號值最低，為9.56 nmol/g。-4 ℃時，組織受寒害嚴(yán)重，細(xì)胞膜脂過氧化程度下降，MDA含量出現(xiàn)不同程度的下降，基本達(dá)到同一水平。在整個變化過程中，2號MDA含量最低，總體均值僅9.11 nmol/g，增幅較小，表明其膜的過氧化程度低，抗寒能力強；而6號和12號含量高，均值分別為10.41 nmol/g和10.31 nmol/g，其抗寒性較差。

圖2 不同低溫脅迫對丙二醛含量的影響Fig. 2 The influence of malondialdehyde content under different low temperature stress

2.3 不同低溫脅迫對脯氨酸含量的影響

在逆境條件下，植物體內(nèi)游離脯氨酸含量顯著增加，脯氨酸增加量在一定程度上反映了其抗逆性，抗寒性強往往積累較多的脯氨酸。各無性系脯氨酸含量變化情況見圖3，0 ℃與對照4 ℃脯氨酸含量差異極小，均值分別為46.65 μg/g和47.66 μg/g，表明0 ℃是組織所能承受的低溫，并未能促使其產(chǎn)生脯氨酸含量增加的生理反應(yīng)。在-2 ℃多數(shù)無性系出現(xiàn)大幅度上升，總體均值為68.02 μg/g，增幅達(dá)43%，除2、5、8及10號外，其余的均達(dá)到最大值，脯氨酸含量最大的為3號（118.02 μg/g），增幅為109%。-4 ℃ 時，2、5、8 及10號出現(xiàn)極大值，其余均有不同程度的下降，差異較大，脯氨酸含量為40.22～101.01 μg/g。整個低溫處理中，3號脯氨酸含量最高，均值82.49 μg/g，增幅較大，其抗寒性強。

圖3 不同低溫脅迫對脯氨酸含量的影響Fig. 3 The influence of proline content under different low temperature stress

2.4 不同低溫脅迫對可溶性蛋白含量的影響

多數(shù)植物在低溫鍛煉期間，細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量與抗寒性之間表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)[23-25]。由圖4可知，橡膠樹枝條組織可溶性蛋白含量變化趨勢存在較大差異，主要分為2類，一類是“降—升—降”，有2、5、10、6及12號等5個無性系；另一類是“升—升—降”，有7個無性系。0 ℃時，多數(shù)無性系可溶性蛋白含量變化較小，總體均值為 100.08 μg/mL，與對照 94.06 μg/mL 相比，增幅為13%，其中增幅最大的1號，為65%，可溶性蛋白含量158.85 μg/mL，表明其在受低溫脅迫時，組織通過快速升高可溶性蛋白含量來增加抗寒性。到-2 ℃時，各無性系均達(dá)到最大峰值且差異極顯著，可溶性蛋白含量在84.00～181.95 μg/mL之間，總體均值為128.23 μg/mL，增幅達(dá)41%，說明此低溫已對組織造成了較大傷害。-4 ℃時，可溶性蛋白含量一致下降，下降幅度除1號較小外，其余無性系均較大，此時組織受極嚴(yán)重傷害，失去了利用可溶性蛋白含量抵御低溫的生理調(diào)節(jié)能力。1號在整個低溫脅迫中可溶性蛋白含量最高，均值為143.69 μg/mL，增幅最大75%，表現(xiàn)出對低溫的極強耐受力，抗寒性最強；同時，4、7和12號，含量都低于60.00 μg/mL，耐低溫能力最弱。

圖4 不同低溫脅迫對可溶性蛋白含量的影響Fig. 4 The influence of soluble protein content under different low temperature stress

2.5 不同低溫脅迫對可溶性糖含量的影響

可溶性糖是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可溶性糖的積累對植物受冷凍害有保護作用，其含量與抗寒性呈正相關(guān)。各無性系可溶性糖含量變化情況見圖5。

圖5 不同低溫脅迫對可溶性糖含量的影響Fig. 5 The influence of soluble sugar content under different low temperature stress

由圖5可看出，不同無性系經(jīng)低溫處理可溶性糖含量變化趨勢差異較大，并未呈現(xiàn)一致規(guī)律，所有無性系在整個處理期間都在5.00～20.50 mg/g范圍內(nèi)。0 ℃時，除3、7、8和9號外，其余均有不同程度的下降；到-2 ℃時，除9號外，均表現(xiàn)為上升趨勢，整體均值最大，為13.65 mg/g，與4 ℃對照均值12.94 mg/g相比，僅增長了5.5%，進一步說明可溶性糖含量在整個低溫脅迫過程中含量變化不大；-4 ℃時，有50%呈下降趨勢，而1、2、3、5、6和8號表現(xiàn)為上升，說明這6個無性系組織內(nèi)通過增加可溶性糖含量來調(diào)節(jié)抗寒能力的生理響應(yīng)較晚。整個低溫處理過程中，可溶性糖含量最高的是5號和7號，均值為16.59 mg/g和15.35 mg/g，最低的為2號和10號，均值為7.66 mg/g和8.96 mg/g。

2.6 利用隸屬函數(shù)對抗寒性進行綜合評價

以相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、脯氨酸、可溶性蛋白及可溶性糖含量等5個指標(biāo)的均值為依據(jù)，計算各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值并進行綜合評價結(jié)果見表1，測定的12份橡膠樹野生種質(zhì)資源抗寒性由強到弱排序為：3＞5＞2＞8＞1＞11＞7＞9＞6＞4＞10＞12。

2.7 橡膠樹無性系生長與抗寒指標(biāo)相關(guān)性分析

按徑圍多重比較結(jié)果（表1）可將12個無性系分成3個等級：生長量最大的有2、3、4和5號；生長量中等的有1、6和8號；生長量一般的有7、9、10、11和12號。同一等級內(nèi)徑圍差異不顯著，而等級間差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。由抗寒性排序可知，4號和6號生長量較大，但抗寒性排序相對靠后，按保留和去除4號和6號2種方法，分別對無性系各指標(biāo)隸屬函數(shù)值、綜合平均值及徑圍等7個指標(biāo)進行相關(guān)性分析。

由表2可知，保留4號和6號時徑圍僅與隸屬函數(shù)綜合值呈顯著正相關(guān)；相對電導(dǎo)率與可溶性蛋白、可溶性糖顯著相關(guān)，多數(shù)指標(biāo)間無顯著相關(guān)性。而當(dāng)去除4號和6號時，徑圍與隸屬函數(shù)綜合值呈極顯著正相關(guān)，此時相關(guān)系數(shù)（0.824）明顯要比前者（0.643）高很多；且分別與相對電導(dǎo)率、丙二醛和可溶性蛋白等指標(biāo)隸屬函數(shù)值呈顯著或極顯著相關(guān)，說明僅少部分（4號和6號）生長較好的種質(zhì)資源與抗寒性之間的相關(guān)性不顯著。

綜上可知，徑圍生長量可用作橡膠樹種質(zhì)資源抗寒性選擇的一個間接指標(biāo)，但需要指出的是用徑圍生長量正向選擇時存在部分誤選，而進行淘汰選擇時效果較好。如本研究以徑圍生長量第1等級為選擇對象，則出現(xiàn)4號一個誤選；如以第3等級為淘汰對象，則排名最前的一個也僅排到第6名，可以都做淘汰處理。

表1 利用隸屬函數(shù)對不同橡膠樹無性系抗寒性進行綜合評價結(jié)果Table 1 The comprehensive evaluation result of cold resistance of different H. brasiliensis clones using membership function

表2 橡膠樹無性系生長與抗寒指標(biāo)相關(guān)性統(tǒng)計Table 2 The statistic of correlation between growth and cold resistance indexes of H. brasiliensis clones

3 結(jié)論與討論

橡膠樹的生長發(fā)育經(jīng)常會受到寒冷脅迫的影響，抗寒性比較強的品種或無性系在長期應(yīng)對低溫等逆境脅迫的過程中形成了功能獨特的物質(zhì)條件[26]。本研究表明，低溫脅迫可誘導(dǎo)橡膠樹啟動抗寒響應(yīng)機制，在生理上產(chǎn)生了一系列的變化。低溫脅迫使橡膠樹幼苗枝條內(nèi)積累了更多的游離脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等物質(zhì)，而這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累可減輕滲透脅迫、防止膜脂和蛋白質(zhì)的過氧化作用，但同時丙二醛也同步增加，不同無性系間各物質(zhì)的含量變化差異較大，但整體看，這幾類物質(zhì)隨不同低溫脅迫后均呈現(xiàn)出了“降—升—降”的變化趨勢，這與多個樹種上的研究結(jié)果相一致[27-28]。

植物抗寒性是一個復(fù)雜的數(shù)量性狀，在進行抗寒性鑒定時，生理指標(biāo)的選擇尤為重要，張衛(wèi)華等[29]研究指出相對電導(dǎo)率、水分狀況、游離脯氨酸和可溶性糖含量等指標(biāo)對相思的抗旱性評價影響力會占到88%以上，尤其相對電導(dǎo)率成為評價其抗旱性的主導(dǎo)因子。本研究以相對電導(dǎo)率來進行選擇時，抗寒性強弱綜合排名靠前的相對電導(dǎo)率相對較小，排名靠后的較大，值得指出的是5號，綜合排名為2，但相對電導(dǎo)率處于中等位置，6號綜合排名靠后，但相對電導(dǎo)率較小，有待多次驗證。馮建燦等[30]指出植物組織內(nèi)脯氨酸含量的高低可以作為衡量喜樹抗寒性強弱的指標(biāo)，本研究可知，脯氨酸含量較高的幾個無性系（3、5、8、11號），抗寒性綜合評價都不差，但也有部分無性系如1和2號，脯氨酸含量較低，但抗寒性綜合評價也較強，根據(jù)李曉宇等[31]對楊樹（Populusspp.）苗期抗寒性研究得出脯氨酸含量與抗寒性關(guān)系不顯著，進一步說明最好不要單一地利用脯氨酸含量這一生理指標(biāo)對植物抗寒性鑒定。丙二醛是膜脂過氧化指標(biāo)，表示細(xì)胞膜過氧化程度和植物對逆境條件反應(yīng)的強弱，在低溫脅迫下，膜的過氧化程度越低，丙二醛含量越低，抗寒性越強[32]。綜上，單一指標(biāo)很難代表植物復(fù)雜的抗寒性，使用多指標(biāo)聯(lián)合分析，才能較好地反映植物的抗寒生理過程。本研究利用隸屬函數(shù)法對12個無性系的相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、脯氨酸、可溶性蛋白及可溶性糖含量等5個指標(biāo)進行綜合評價，其抗寒性由強到弱的排序依次為：3＞5＞2＞8＞1＞11＞7＞9＞6＞4＞10＞12。從相關(guān)性分析結(jié)果來看，選擇的抗寒指標(biāo)間只有相對電導(dǎo)率與丙二醛和可溶性蛋白含量呈顯著或極顯著相關(guān)性，其他大多數(shù)指標(biāo)兩兩相關(guān)性均不強，特別是脯氨酸與其他指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)均較小，而綜合隸屬函數(shù)值與大多數(shù)指標(biāo)間相關(guān)系數(shù)都在0.5以上（可溶性糖除外），且與多數(shù)指標(biāo)達(dá)到顯著或極顯著水平，說明用隸屬函數(shù)值綜合評價橡膠樹無性系的抗寒性比單一指標(biāo)較科學(xué)。

前人對林木的生長與抗寒性之間的關(guān)系也做了一些研究，劉勇等[33]研究指出三倍體毛白楊（Populus tomentosa）速生前期合理施肥，能使苗高、地徑生長量變大，高徑比恰當(dāng)，苗木生長好，苗木的抗寒性也得到提高；解荷鋒等[34]對美洲黑楊（Populus nigra）無性系的生長與抗寒性研究表明生長和抗寒性與無性系的起源有密切關(guān)系，其生長量與抗寒性呈負(fù)相關(guān)；何旭東等[35]對細(xì)葉桉（Eucalyptus tereticornis）以及楊秀艷等[36]對楊樹無性系的生長和抗寒性進行了聯(lián)合選擇，評選出了大量速生、抗寒的無性系，表明速生性與抗寒性可以同步進行選擇。本研究重點分析了橡膠樹生長與抗寒性的關(guān)系，結(jié)果表明，橡膠樹無性系抗寒性與徑圍呈顯著正相關(guān)，即大多數(shù)生長勢好的無性系具有較強的抗寒性，少數(shù)幾個無性系例外（如4號），而生長勢較差的幾個無性系其抗寒性均很差（如10號和12號）。本研究因從生理生化指標(biāo)方面綜合評價抗寒性，故選擇的無性系數(shù)量有限，但結(jié)合前人在其他樹種上的部分研究結(jié)果，可將橡膠樹的生長量與抗寒性相結(jié)合進行種質(zhì)資源批量鑒定，建議以木材利用為主且寒害較重的生態(tài)區(qū)域選育品種時，進行超速生資源優(yōu)選的策略；在以膠乳產(chǎn)量為主要選育目標(biāo)時，先進行生長量淘汰選擇，再進一步做精準(zhǔn)鑒定。