顏新建,李高峰*,吳添雨,袁仕善,張慧慧,楊小平

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院腫瘤科,中國湖南株洲412000;2.小分子靶向藥物研究與創(chuàng)制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院,中國湖南長沙410013)

共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因(ataxia-telangiectasia mutated gene,ATM)作為一個(gè)抑癌基因和DNA修復(fù)基因在腫瘤中研究廣泛,其參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷識別和修復(fù),與腫瘤發(fā)病機(jī)制、細(xì)胞放射敏感性關(guān)系密切[1～2]。DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式之一[3],目前研究報(bào)道多個(gè)瘤種如乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌等存在ATM基因啟動(dòng)子異常甲基化[4～5],且ATM基因啟動(dòng)子異常甲基化與腫瘤放射敏感性密切相關(guān)[6]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)ATM基因與原發(fā)性肝癌發(fā)病機(jī)制及輻射增敏相關(guān)[7～8],但其內(nèi)在原因尚不清楚,而有關(guān)肝癌ATM基因啟動(dòng)子甲基化的研究暫未見報(bào)道,因此我們就原發(fā)性肝癌ATM基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及其與放療療效的相關(guān)性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 研究對象

從中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院病理科選取2016年6月至2018年6月的肝癌手術(shù)切除標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁肝組織共50對,包括男性38例,女性12例,患者年齡在35～73歲之間,平均年齡53.2±3.2歲,其中肝癌合并肝硬化患者25例,肝癌合并肝硬化患者中Child-Pugh A級者13例,Child-Pugh B級者6例,Child-Pugh C級者6例;同時(shí)收集20例正常肝組織。另外,隨機(jī)收集2017年8月至2018年10月在我院腫瘤科住院的局部中晚期肝癌肝穿刺標(biāo)本38例,入組標(biāo)準(zhǔn)：1)病理檢查確診為肝細(xì)胞癌;2)年齡在18～70歲;3)TNM分期為IIb期、IIIa期、IIIb期之一。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)病理檢查診斷肝癌為膽管細(xì)胞型或混合型;2)臨床分期為IV期,且存在全身多處轉(zhuǎn)移;3)治療開始前KPS評分低于70分,預(yù)計(jì)不能耐受全程放療者;4)證實(shí)腫瘤原發(fā)灶非肝臟,由其他部位轉(zhuǎn)移至肝臟者;5)患者及家屬不同意進(jìn)入試驗(yàn)。每個(gè)穿刺標(biāo)本取2～3條合格組織置于-80℃冰箱保存待用。以上組織的病理結(jié)果均經(jīng)我院兩位高年資病理科醫(yī)生確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)組與對照組的年齡、性別等參數(shù)經(jīng)比較無顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過患者及家屬的口頭知情同意,并在醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)下進(jìn)行。

1.2 材料

石蠟包埋組織DNA提取試劑盒、DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒、甲基化特異性PCR試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。人甲基化和非甲基化DNA標(biāo)準(zhǔn)品購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。

1.3 DNA提取及重亞硫酸鹽修飾

根據(jù)石蠟包埋組織DNA提取試劑盒操作說明書提取樣品DNA,采用酶標(biāo)儀測定OD260/OD280值,比值在1.7～1.9之間視為合格,所提取DNA的質(zhì)量用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。取合格DNA樣品1 000 ng,按照DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒操作方法進(jìn)行重亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化后用獨(dú)特的吸附柱技術(shù)完成DNA純化,隨后回收樣品。

1.4 甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(methylation-specific PCR,MSP)及DNA電泳

實(shí)驗(yàn)按照甲基化特異性PCR試劑盒操作方法進(jìn)行。首先設(shè)計(jì)兩對特異擴(kuò)增引物,引物序列用Methprimer軟件設(shè)計(jì),并預(yù)測CpG島位置;甲基化引物：上游 5＇GTTTTCGTTAGAGAAAGAAAGGC3＇,下游 5＇CAATAACCAACGACTTAACG3＇;非甲基化引物：上游5＇GTTTTTGTTAGAGAAAGAAAGGTG3＇,下游 5＇CAATAACCAACGACTTAACG3＇。MSP 反應(yīng)體系(總共 20 μL)：DNA 模板 2 μL,上下游引物(濃度 10 μmol/L)各 1 μL,MSP DNA polymerase 0.4 μL,10× MSP PCR buffer 1.7 μL,dNTPs 1.4 μL,ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min→(94℃ 20 s,57℃ 30 s,72℃20 s)×35 cycles→72℃ 5 min。反應(yīng)設(shè)置空白對照組(ddH2O組)、甲基化對照組及非甲基化對照組,甲基化對照組所用DNA模板為完全甲基化的DNA標(biāo)準(zhǔn)品,非甲基化對照組所用DNA模板為非甲基化的DNA標(biāo)準(zhǔn)品。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析,用天能紫外光系統(tǒng)拍照。

1.5 亞硫酸氫鹽處理后的測序驗(yàn)證

采用BSP(bisulfite sequencing PCR)法對肝癌組織甲基化狀態(tài)進(jìn)行測序驗(yàn)證(委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司實(shí)施),比對測序結(jié)果與電泳結(jié)果,證實(shí)有無甲基化,并判斷甲基化程度。

1.6 放射治療方案與療效評價(jià)體系

由我院腫瘤科兩位副高及以上職稱醫(yī)師對38例局部中晚期原發(fā)性肝癌患者制定放療計(jì)劃,靶區(qū)勾畫原則：大體腫瘤體積(gross tumor volume,GTV)為影像學(xué)確認(rèn)的腫瘤靶病灶,臨床靶區(qū)(clinical tumor volume,CTV)為在GTV基礎(chǔ)上外擴(kuò)1.0 cm,計(jì)劃靶體積(planning target volume,PTV)為在CTV基礎(chǔ)上向上下擴(kuò)2.0 cm,左右擴(kuò)1.0 cm,細(xì)節(jié)稍加修改。38例肝癌患者均接受適形調(diào)強(qiáng)放療,放療處方：總劑量60 Gy,每次2 Gy,1次/日,5次/周。放療過程中為增加放療敏感性,予以“順鉑40 mg/m2ivgtt D1”治療,每周一次,共用6周;放療過程中每周監(jiān)測血象、肝腎功能等,并行護(hù)肝及對癥支持治療。

放療結(jié)束一個(gè)月后進(jìn)行初始放療療效評估,初始評價(jià)一個(gè)月后再次復(fù)查肝臟MRI(magnetic resonance imaging)或 CT(computed tomography)增強(qiáng)等,綜合兩次復(fù)查結(jié)果完成總體療效評價(jià)。評價(jià)體系采用國際通用EASL(European Association for the Study of the Liver)療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn),即完全緩解(complete response,CR)：所有存活腫瘤完全消失,治療區(qū)域沒有新發(fā)病灶,至少持續(xù)4周;部分緩解(partial response,PR)：所有可測量病灶總的存活腫瘤負(fù)荷縮小50%以上,至少持續(xù)4周;病情穩(wěn)定(stable disease,SD)：所有不符合 CR、PR、PD的情況;疾病進(jìn)展(progressive disease,PD)：一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)病灶的存活腫瘤增大超過25%,或在治療區(qū)域有新的病灶出現(xiàn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn),相關(guān)性分析用Spearman檢驗(yàn),顯著性水平為 P＜0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 ATM基因啟動(dòng)子甲基化分析

甲基化對照使用全甲基化人DNA作為模板,只擴(kuò)增出甲基化條帶(M帶);非甲基化對照只擴(kuò)增出非甲基化條帶(U帶)。根據(jù)是否擴(kuò)增出相應(yīng)條帶判斷樣本有無甲基化,即樣本擴(kuò)增出M帶判為有甲基化,樣本擴(kuò)增出U帶判為無甲基化,兩條帶均有判為部分甲基化。BSP測序結(jié)果顯示,存在ATM基因啟動(dòng)子甲基化的樣本其CpG島胞嘧啶(C-CH3)經(jīng)重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換后不會轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶(T),而無ATM基因啟動(dòng)子甲基化的樣本其CpG島胞嘧啶(C)經(jīng)重亞硫酸氫鹽處理后轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶(T)。測序結(jié)果與電泳結(jié)果相一致,證實(shí)結(jié)果可靠。

MSP檢測發(fā)現(xiàn)肝癌組織存在ATM基因啟動(dòng)子異常甲基化(包括完全甲基化和部分甲基化),甲基化率達(dá)39.8%。50例肝癌手術(shù)標(biāo)本中,19例(占38%)存在ATM基因啟動(dòng)子甲基化,相應(yīng)癌旁肝組織僅4例(占8.0%)存在ATM基因啟動(dòng)子甲基化;38例肝癌穿刺標(biāo)本有16例(占42.1%)存在ATM基因啟動(dòng)子甲基化;正常肝組織無ATM基因啟動(dòng)子甲基化。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,ATM基因啟動(dòng)子甲基化在肝癌組織中的發(fā)生率與癌旁肝組織和正常肝組織相比具有顯著性差異(χ2=24.818,P＜0.05)。代表性分析結(jié)果見圖1和圖2。

2.2 ATM基因啟動(dòng)子甲基化與臨床特征的關(guān)系

ATM基因啟動(dòng)子甲基化與患者年齡、性別、臨床分期、AFP(alpha fetoprotein)水平、門脈癌栓、腫瘤直徑、組織分化水平無明顯相關(guān)性,但與肝硬化、Child-Pugh分級顯著相關(guān),具體結(jié)果見表1。

2.3 ATM基因啟動(dòng)子甲基化與肝癌放療療效的相關(guān)性

38例局部中晚期肝癌患者中,16例存在ATM基因啟動(dòng)子甲基化,其中完全緩解(CR)1例,部分緩解(PR)7例,放療有效率50.0%;22例ATM基因啟動(dòng)子無甲基化,其中完全緩解(CR)0例,部分緩解(PR)3例,放療有效率13.6%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,存在ATM基因啟動(dòng)子甲基化的患者其放療療效明顯優(yōu)于無甲基化的患者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.955,P=0.015)。Spearman 檢驗(yàn)結(jié)果顯示ATM基因啟動(dòng)子甲基化與肝癌放療療效呈顯著正相關(guān)(r=0.396,P=0.014),而Child-Pugh分級、肝硬化、門脈癌栓與肝癌放療療效無明顯相關(guān)性,具體結(jié)果見表2和表3。

圖1 部分樣本ATM基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)示例Marker：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì);1～2：肝癌手術(shù)組織;3：肝癌穿刺活檢組織;4：癌旁肝組織;5：甲基化對照;6：非甲基化對照;M：甲基化條帶;U：非甲基化條帶。Fig.1 Methylation status of ATM gene promoter in several samplesMarker：Standard protein;1～2：HCC surgical tissues;3：HCC puncture biopsy specimen;4：HCC corresponding paracancerous tissue;5：Methylated control;6：Unmethylated control;M：Methylation band;U：Unmethylation band.

圖2 部分肝癌樣本的BSP結(jié)果ATM methylation：ATM基因甲基化,經(jīng)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后胞嘧啶(C)不變;ATM unmethylation：ATM基因非甲基化,經(jīng)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后胞嘧啶(C)變成胸腺嘧啶(T)。Fig.2 BSP results of partial HCC specimensATM methylation：Cytosine(C)unchanged after heavy sulfite transforming;ATM unmethylation：Cytosine(C)converted to thymine(T)after heavy sulfite transforming.

表1 肝癌組織ATM基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationship between methylation status of ATM promoter and clinical characteristics in HCC

3 討論

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一,也是在我國發(fā)病率中居第4位的惡性腫瘤[9]。肝癌在診斷時(shí)多偏中晚期,其進(jìn)展快、預(yù)后差等,防治形勢不容樂觀。目前肝癌的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚,原癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活是細(xì)胞失去正常生長調(diào)控而惡變的分子基礎(chǔ)。ATM基因是少見病共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(ataxia telangiectasia,AT)的致病基因,但作為一個(gè)抑癌基因和DNA修復(fù)基因在腫瘤發(fā)病及輻射增敏中研究廣泛。ATM基因編碼的ATM蛋白激酶是細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)的中心元件,特別是對于放射線引起的DNA雙鏈斷裂,它能識別DNA損傷信號,快速將RAD50/MRE11/NBS1復(fù)合物募集到斷裂損傷部位,并激活下游一系列分子如組蛋白H2AX、染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白1(structural maintenance chromosome 1,SMC1)、細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶1/2(cell cycle checkpoint kinase 1/2,CHK1/2)、P53 等,介導(dǎo)數(shù)條信號通路,從而修復(fù)DNA損傷,維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性[10]。ATM蛋白激酶還可以活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號通路,使受損傷細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性增加,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過度生長和腫瘤細(xì)胞對放化療抵抗性的增加。ATM基因功能缺失或沉默可以通過下調(diào)ATM蛋白激酶功能使細(xì)胞DNA損傷修復(fù)機(jī)制障礙,對于放射線引起的DNA雙鏈斷裂不能及時(shí)反應(yīng)、修復(fù),從而導(dǎo)致細(xì)胞對放射線高度敏感。抑癌基因啟動(dòng)子甲基化被認(rèn)為是抑癌基因表達(dá)異常中除突變和缺失外的第三種分子機(jī)制[11]。研究報(bào)道,多種腫瘤細(xì)胞存在ATM基因啟動(dòng)子異常甲基化。Delmonico等[12]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌病人組織及血液、唾液細(xì)胞中均存在ATM基因啟動(dòng)子異常甲基化,且組織中ATM基因啟動(dòng)子甲基化率最高;Mehdipour等[4]研究發(fā)現(xiàn)在不同類型腦腫瘤中73%的組織樣本存在ATM基因啟動(dòng)子甲基化,且這些樣本中ATM蛋白低表達(dá)。需要指出的是,Cao等[13]對乳腺乳頭狀癌患者和正常對照者的外周血進(jìn)行ATM基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)檢測時(shí)發(fā)現(xiàn),兩組ATM基因啟動(dòng)子的甲基化率無明顯區(qū)別,該研究認(rèn)為血清ATM基因啟動(dòng)子甲基化尚不能作為乳腺癌的診斷標(biāo)志物。該研究得出陰性結(jié)果可能是因?yàn)檠逯杏坞xDNA與病變組織DNA在含量及穩(wěn)定性上相差很大,提取DNA技術(shù)亦有差別,當(dāng)基因甲基化水平不高或僅存在部分甲基化時(shí),外周血標(biāo)本很有可能出現(xiàn)陰性結(jié)果,此時(shí)其真實(shí)的ATM基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)未能體現(xiàn)。

表2 不同甲基化狀態(tài)的局部中晚期肝癌患者放療療效統(tǒng)計(jì)Table 2 Radiotherapy efficacy statistics of locally advanced HCC patients with different methylation status

表3 Spearman檢驗(yàn)ATM基因啟動(dòng)子甲基化等與肝癌放療療效的相關(guān)性Table 3 The correlation between ATM gene promoter methylation etc.and radiotherapy efficacy for HCC determined by Spearman test

原發(fā)性肝癌中ATM基因啟動(dòng)子甲基化情況如何？首先,本研究利用Methprimer軟件設(shè)計(jì)ATM基因甲基化和非甲基化特異性引物,預(yù)測ATM基因CpG島位置,發(fā)現(xiàn)人ATM基因啟動(dòng)子的CpG島位于第11號染色體(108 222 097～108 222 457),長約361 bp,CG含量超過50%。此外,本研究結(jié)果顯示原發(fā)性肝癌中ATM基因啟動(dòng)子CpG島存在異常甲基化,總體甲基化率達(dá)39.8%,而癌旁肝組織的ATM基因啟動(dòng)子甲基化率極低,正常肝組織則無ATM基因啟動(dòng)子甲基化,肝癌中ATM基因啟動(dòng)子甲基化率明顯高于癌旁肝組織和正常肝組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.818,P＜0.05,圖 1),這與文獻(xiàn)研究結(jié)果[4,12]基本一致。以上信息提示ATM基因啟動(dòng)子出現(xiàn)甲基化是肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中一個(gè)重要的分子事件,各種致病因素導(dǎo)致的ATM基因啟動(dòng)子異常甲基化可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄輔助因子結(jié)合到轉(zhuǎn)錄部位等多種機(jī)制使轉(zhuǎn)錄抑制,造成ATM基因低表達(dá)或沉默,導(dǎo)致細(xì)胞生長調(diào)控紊亂和DNA損傷修復(fù)障礙,使肝癌高危人群腫瘤易感性增加[14]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),對于ATM基因啟動(dòng)子甲基化率,合并肝硬化的肝癌患者顯著高于不合并肝硬化的肝癌患者(χ2=5.839,P=0.016),Child-Pugh C級、Child-Pugh B級肝癌患者顯著高于Child-Pugh A級肝癌患者(χ2=9.194,P=0.010,表1),并且出現(xiàn)了Child-Pugh C級＞Child-Pugh B級＞Child-Pugh A級逐級遞增的現(xiàn)象。其中,合并肝硬化的肝癌患者ATM基因啟動(dòng)子甲基化率較高可能與持續(xù)乙肝病毒感染以及肝臟長期發(fā)生炎癥、免疫反應(yīng)等有關(guān)。此外,在合并肝硬化的肝癌患者中ATM基因啟動(dòng)子甲基化水平隨著Child-Pugh分級增加而增加,提示ATM基因發(fā)生異常甲基化可能是肝癌發(fā)生的早期事件,甚至在肝硬化階段就開始出現(xiàn)啟動(dòng)子CpG島胞嘧啶(C)甲基化修飾,ATM基因啟動(dòng)子CpG島異常甲基化使ATM基因功能異常,引發(fā)多種機(jī)制綜合作用,最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展。

ATM基因啟動(dòng)子甲基化與放射敏感性關(guān)系密切[1～6]。Roy等[6]研究發(fā)現(xiàn)存在ATM基因啟動(dòng)子甲基化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞相較于無甲基化的細(xì)胞其放射敏感性提高2倍以上。本研究也發(fā)現(xiàn)存在ATM基因啟動(dòng)子甲基化的肝癌患者其放療療效明顯優(yōu)于無甲基化的患者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.955,P=0.015,表2),而且Spearman檢驗(yàn)顯示ATM基因啟動(dòng)子甲基化與肝癌放療療效呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.396,P=0.014,表3),這很可能與ATM基因功能異常有關(guān)。抑癌基因啟動(dòng)子甲基化可以通過抑制轉(zhuǎn)錄過程等引起基因沉默,ATM基因作為一個(gè)抑癌基因可以通過上述機(jī)制被誘導(dǎo)沉默。同時(shí),作為一個(gè)DNA修復(fù)基因,ATM基因低表達(dá)或沉默使細(xì)胞DNA損傷修復(fù)障礙,這樣細(xì)胞對放射線引起的DNA雙鏈斷裂不能及時(shí)反應(yīng)、修復(fù),導(dǎo)致放療引起的細(xì)胞死亡量成倍增加,最終使病人的放療療效明顯提高。如果能利用ATM基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)差異這一切入點(diǎn)篩選出高放射敏感性的肝癌病人,甚至將ATM基因作為放射增敏靶點(diǎn),開發(fā)靶向輻射增敏藥物,這將對肝癌防治具有十分重大的意義,但因本實(shí)驗(yàn)研究對象偏少,且治療過程中影響因素較多,結(jié)果還有待進(jìn)一步完善。

總之,本研究在較多人體肝癌組織標(biāo)本上檢測了ATM基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài),分析了其與肝癌臨床特征的關(guān)系及與放療療效的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌ATM基因啟動(dòng)子區(qū)存在異常甲基化,ATM基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與肝癌放療療效關(guān)系密切,可為篩選放射敏感差異病人提供新的思路。