張 濤，牛建功，劉 鴻，焦 飛，張人銘，蔡林鋼

(新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，新疆 烏魯木齊 830000)

扁吻魚(yú)(Aspiorhynchuslaticeps)又名新疆大頭魚(yú)，隸屬鯉形目、鯉科、裂腹魚(yú)亞科、扁吻魚(yú)幼魚(yú)屬。本屬全世界僅一種，為我國(guó)塔里木河水系的特有魚(yú)類(lèi)[1]。扁吻魚(yú)已被列為國(guó)家一級(jí)保護(hù)水生動(dòng)物[2]，在新疆被稱(chēng)為“水中大熊貓”。其野外種群數(shù)量分布極少，1958—1965年，博斯騰湖扁吻魚(yú)幼魚(yú)年產(chǎn)140～260 t，但已基本絕跡，目前野外種群僅分布在渭干河克孜爾水庫(kù)[3]。

我國(guó)對(duì)魚(yú)類(lèi)標(biāo)記放流工作十分重視，2018年在新疆開(kāi)展了扁吻魚(yú)幼魚(yú)首次標(biāo)記放流工作，標(biāo)記采用方法之一為熒光藥物(茜素紅S)浸泡法。茜素紅(Alizarin red，AR)是眾多染料中的一種，屬于蒽醌類(lèi)化合物，被廣泛用于染料、酸堿指示劑，具有較高毒性、復(fù)雜結(jié)構(gòu)以及化學(xué)需氧量(COD)值大等特點(diǎn)，是具有代表性的染料之一[4]。茜素紅S(ARS)是一種染料型配位劑，在分光光度分析方面已有了廣泛的應(yīng)用。茜素紅S可以與鈣離子配合形成沉淀[5]，沉積在骨骼中，形成熒光標(biāo)記[6]；茜素紅S相較于鹽酸四環(huán)素及茜素絡(luò)合指示劑更具價(jià)格優(yōu)勢(shì)，適合大規(guī)模標(biāo)記使用[7]。經(jīng)染色的魚(yú)類(lèi)耳石、鰭條及其他骨組織可以通過(guò)熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)明顯的熒光標(biāo)記。同時(shí)，熒光藥物(茜素紅S)浸泡法，是一種操作簡(jiǎn)單、對(duì)魚(yú)體傷害小的標(biāo)記方法，但過(guò)高濃度引起致死率高；因此，篩選出適宜的茜素紅S標(biāo)記濃度，對(duì)扁吻魚(yú)幼魚(yú)的標(biāo)記工作具有重要的指導(dǎo)意義。熒光藥物浸泡法標(biāo)記魚(yú)類(lèi)使用廣泛，目前，國(guó)內(nèi)對(duì)熒光藥物浸泡稀有魚(yú)句鯽、彭澤鯽[8]、鳡魚(yú)[9]、胭脂魚(yú)[10]、重口裂腹魚(yú)[11]等已有相關(guān)研究；常用水產(chǎn)藥物對(duì)扁吻魚(yú)幼魚(yú)的急性毒性也已見(jiàn)刊[12]，但至今關(guān)于扁吻魚(yú)幼魚(yú)標(biāo)記放流工作中熒光藥物浸泡的急性毒性相關(guān)研究尚處于空白。通過(guò)設(shè)置不同濃度梯度的茜素紅S溶液，準(zhǔn)確掌握藥物對(duì)扁吻魚(yú)幼魚(yú)的毒性影響，旨在為扁吻魚(yú)幼魚(yú)增殖放流中的大規(guī)模標(biāo)記工作提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料魚(yú)取自新疆阿克蘇地區(qū)扁吻魚(yú)幼魚(yú)原種場(chǎng)，運(yùn)輸至克孜爾水庫(kù)管理局養(yǎng)殖車(chē)間暫養(yǎng)，7 d后挑選體表無(wú)傷、游動(dòng)迅速、個(gè)體差異不大的扁吻魚(yú)幼魚(yú)用于試驗(yàn)。隨機(jī)抽樣25尾測(cè)得扁吻魚(yú)幼魚(yú)體長(zhǎng)范圍為(8.7±0.2)cm，體重范圍為(5.8±0.6)g。試驗(yàn)期間所用養(yǎng)殖容器為長(zhǎng)50 cm×寬30 cm×高30 cm的玻璃水族箱，試驗(yàn)前用高錳酸鉀溶液進(jìn)行消毒，每個(gè)容器盛水25 L，水溫10℃。200 W氧氣泵及材料一套，用于試驗(yàn)期間養(yǎng)殖箱中水體的增氧。

1.2 試驗(yàn)藥品

試驗(yàn)所用的茜素紅S(NA)(C14H7NaO7S)為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，分子量342.26，生產(chǎn)批號(hào)：1002637274。前期先配制成1 g/L的母液，以備后期試驗(yàn)使用。

1.3 試驗(yàn)方法

參照霍來(lái)江[13]的研究結(jié)果，為確定茜素紅S濃度的大致范圍，設(shè)定預(yù)試驗(yàn)茜素紅S濃度梯度為100、200、400、800、1 000 mg/L共5個(gè)濃度組，每個(gè)濃度組放16尾扁吻魚(yú)幼魚(yú)，24 h后觀察幼魚(yú)狀態(tài)，確定無(wú)死亡效應(yīng)的茜素紅S最大濃度及100%致死濃度。正式試驗(yàn)在無(wú)死亡效應(yīng)的茜素紅S最大濃度和100%致死濃度之間按照等差數(shù)列設(shè)置試驗(yàn)濃度梯度組和1個(gè)空白對(duì)照組，茜素紅S濃度分別為0、400、500、600、700、800、900 mg/L。設(shè)置3組平行試驗(yàn)組，每個(gè)濃度試驗(yàn)箱放入16尾扁吻魚(yú)幼魚(yú)，在試驗(yàn)中，每隔4 h觀察幼魚(yú)狀況，將死亡的扁吻魚(yú)幼魚(yú)撈出并記錄數(shù)量及死亡時(shí)間。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)。

半致死質(zhì)量濃度 LC50按寇氏法 (Karder)[14]求出：

Log LC50=Xm-d(∑p-0.5)

式中,Xm為死亡組最大劑量的對(duì)數(shù)；d為相鄰組濃度對(duì)數(shù)差；p為各組的死亡率；∑p為各組死亡率的總和。

將茜素紅S的濃度轉(zhuǎn)換為濃度對(duì)數(shù)，作為橫坐標(biāo)；致死率作為縱坐標(biāo)，用Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，擬合回歸直線方程。

安全濃度SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2

式中，SC為安全質(zhì)量濃度；24 h LC50和 48 h LC50分別為24 h和48 h半致死質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 扁吻魚(yú)幼魚(yú)的中毒癥狀

茜素紅S對(duì)扁吻魚(yú)幼魚(yú)的急性中毒表現(xiàn)為魚(yú)體游動(dòng)出現(xiàn)異常，初期不時(shí)地劇烈游動(dòng)、身體平衡性降低，鰓蓋活動(dòng)頻次加快；后期扁吻魚(yú)幼魚(yú)游動(dòng)緩慢，原地打轉(zhuǎn)，體表及各鰭條沾染紅色絮狀物，呼吸減緩，直至喪失游動(dòng)能力，沉至養(yǎng)殖箱底部。觀察死亡的扁吻魚(yú)幼魚(yú)可發(fā)現(xiàn)各鰭條染色較重，口部微張，肛門(mén)處紅腫；解剖發(fā)現(xiàn)死亡個(gè)體肝臟腫大且顏色發(fā)黑，腸道出現(xiàn)潰爛，鰓絲發(fā)暗且黏連有紅色絮狀物。

2.2 茜素紅S對(duì)扁吻魚(yú)幼魚(yú)的急性毒性

不同濃度的茜素紅S對(duì)扁吻魚(yú)幼魚(yú)的急性毒性不同，隨著濃度的升高，扁吻魚(yú)幼魚(yú)的死亡率升高(表1)。在低濃度組400 mg/L時(shí)，扁吻魚(yú)幼魚(yú)未出現(xiàn)死亡，當(dāng)茜素紅S濃度為500 mg/L，72 h出現(xiàn)首次死亡；在中濃度組600 mg/L時(shí)，在44 h出現(xiàn)首次死亡，96 h死亡率為43.75%，當(dāng)茜素紅S濃度為700 mg/L時(shí)，首次死亡發(fā)生在24 h，死亡率為12.50%，96 h時(shí)全部死亡；在高濃度組800 mg/L時(shí)，扁吻魚(yú)幼魚(yú)首次死亡發(fā)生在20 h，48 h死亡率為81.25%，72 h時(shí)全部死亡，當(dāng)茜素紅S濃度為900 mg/L時(shí)，首次死亡發(fā)生在8 h，24 h時(shí)死亡率100%。

表1 茜素紅S對(duì)扁吻魚(yú)幼魚(yú)的急性毒性結(jié)果

注：“—”代表該處理組全部死亡。

Note：“—”denoted all of juveniles were dead.

表2 茜素紅S對(duì)扁吻魚(yú)幼魚(yú)的半致死濃度和安全濃度

注：y為死亡率概率單位，x為濃度對(duì)數(shù)。

Notes：ywas probit of mortality，xwas logarithm of copper ion concentration.

茜素紅S質(zhì)量濃度對(duì)扁吻魚(yú)幼魚(yú)死亡率的線性方程如圖1所示，通過(guò)寇氏法公式計(jì)算出24 h的LC50值為788 mg/L，48 h的LC50值為718 mg/L，72 h的LC50值為651 mg/L，96 h的LC50值為618 mg/L。代入公式SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2，求出茜素紅S對(duì)扁吻魚(yú)幼魚(yú)的安全濃度(SC)為179 mg/L(表2)。

3 討論

急性毒性試驗(yàn)是指在24 h內(nèi)動(dòng)物接受藥物1～2次(間歇時(shí)間為6～8 h)，動(dòng)物所表現(xiàn)出的毒性反應(yīng)。研究茜素紅S對(duì)扁吻魚(yú)幼魚(yú)的急性毒性，能夠?yàn)榻窈蟊馕囚~(yú)幼魚(yú)大規(guī)模藥物浸泡熒光標(biāo)記放流提供數(shù)據(jù)參考。

大量試驗(yàn)證實(shí)，魚(yú)類(lèi)的致死率與熒光標(biāo)記藥物濃度的升高呈現(xiàn)正相關(guān)性。歐陽(yáng)斌等[8]在熒光物質(zhì)浸泡標(biāo)記稀有魚(yú)句鯽和彭澤鯽仔、稚魚(yú)的研究中發(fā)現(xiàn)，茜素絡(luò)合物在濃度為30～150 mg/L(浸泡24 h)時(shí)，稀有魚(yú)句鯽和彭澤鯽幼魚(yú)成活率大多達(dá)到100%；在濃度為200 mg/L時(shí)，死亡率為100%。付自東等[10]在胭脂魚(yú)熒光藥物浸泡試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)茜素絡(luò)合物在濃度為50～200 mg/L(浸泡24 h)時(shí)，幼魚(yú)無(wú)死亡；在濃度為250 mg/L時(shí)，幼魚(yú)死亡率為90%。何春林等[11]在研究重口裂腹魚(yú)時(shí)，發(fā)現(xiàn)茜素絡(luò)合物濃度≤350 mg/L時(shí)(浸泡12 h)，幼魚(yú)無(wú)死亡；當(dāng)濃度≥400 mg/L(浸泡12 h)，幼魚(yú)全部死亡。梁小雙等[5]在研究紅鰭笛鯛標(biāo)記技術(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)茜素紅S濃度為100 mg/L時(shí)(浸泡36 h)，紅鰭笛鯛無(wú)死亡；在濃度為600 mg/L時(shí)，紅鰭笛鯛全部死亡。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，扁吻魚(yú)幼魚(yú)在茜素紅S濃度為400 mg/L時(shí)(浸泡96 h)，幼魚(yú)無(wú)死亡；在濃度為700 mg/L時(shí)，全部死亡；印證了高濃度的熒光標(biāo)記藥物會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)較高的致死率。

試驗(yàn)結(jié)果表明，茜素紅S對(duì)扁吻魚(yú)幼魚(yú)的安全質(zhì)量濃度為179 mg/L，要高于中華倒刺鲃?dòng)佐~(yú)[13]的59.56 mg/L。根據(jù)危險(xiǎn)化學(xué)品魚(yú)類(lèi)急性毒性分級(jí)試驗(yàn)方法的等級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，將96 h LC50分為4級(jí) ：96 h LC50>10.0 mg/L為低毒；1.0 mg/L<96 h LC50≤10.0 mg/L為中毒；0.1 mg/L<96 h LC50≤1.0 mg/L為高毒；96 h LC50<0.1 mg/L為劇毒[15]。茜素紅S的96 h LC50為179 mg/L，故判定茜素紅S對(duì)扁吻魚(yú)幼魚(yú)為低毒性藥物，從藥物毒性考慮，該熒光藥物適合扁吻魚(yú)幼魚(yú)的標(biāo)記。從扁吻魚(yú)幼魚(yú)的中毒癥狀可知，高濃度茜素紅S對(duì)魚(yú)的體表及鰓部均有較嚴(yán)重?fù)p傷；解剖發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝膽傷害較大，故濃度過(guò)高會(huì)損害扁吻魚(yú)幼魚(yú)的體表黏膜及肝臟功能。茜素紅S濃度為400 mg/L時(shí)，96 h未出現(xiàn)死亡，因此在茜素紅S浸泡標(biāo)記扁吻魚(yú)幼魚(yú)時(shí)，建議濃度設(shè)置在179～400 mg/L之間，以確保標(biāo)記時(shí)用藥的安全性和有效性，同時(shí)取得較好的標(biāo)記效果；下一步的工作應(yīng)研究恰當(dāng)?shù)臉?biāo)記濃度及浸泡時(shí)間，了解不同浸泡時(shí)間下的標(biāo)記效果及標(biāo)記色的保留時(shí)間，以期最終指導(dǎo)扁吻魚(yú)幼魚(yú)人工增殖放流中的熒光藥物標(biāo)記工作。