趙遠(yuǎn)超 葉 茂 孔令雅 萬金忠 黃 丹 張忠云 夏 冰張勝田 馮彥房 孫明明 武 俊 胡 鋒 蔣 新 杜良成

（1 中國科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點實驗室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008）（2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院土壤生態(tài)實驗室，南京 210095）（3 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所土壤污染防治研究中心，南京 210042）（4 安徽省環(huán)境科學(xué)研究院，合肥 230022）（5 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，南京 210014）（6 University of Nebraska—Lincoln，Lincoln，Nebraska，Lincoln 68588，USA）

由于我國現(xiàn)階段畜禽糞便安全化處理技術(shù)或環(huán)境管理仍存在一定的不足或缺失，許多城郊畜牧業(yè)養(yǎng)殖廠周邊的農(nóng)田土壤常成為殘留和滋生人畜共患病原菌的高風(fēng)險熱點區(qū)域，嚴(yán)重影響人體健康和環(huán)境安全［1］。因而，針對病原菌污染農(nóng)田土壤，開展必要的生物修復(fù)技術(shù)研究十分迫切。

噬菌體療法（Phage therapy）為修復(fù)上述污染土壤提供了一種全新途徑。細(xì)菌噬菌體（簡稱噬菌體）是一類較為專屬捕食活體宿主細(xì)菌而存活的生物體，在土壤、水、空氣乃至人/動物體表或腸道內(nèi)均廣泛分布了大量噬菌體，據(jù)估算其總量達(dá)到1031數(shù)量級［2］。噬菌體療法是指通過分離、篩選、純化和富集宿主病原菌的專屬噬菌體之后，向污染土壤中添加特定噬菌體菌液，定向侵染滅活病原菌的修復(fù)方式［3-4］。國外學(xué)者已成功將噬菌體療法應(yīng)用在滅活辣椒、番茄、葡萄等果蔬的植物病害細(xì)菌或人畜共患致病細(xì)菌的食品安全保障領(lǐng)域［5-6］。然而，使用噬菌體療法來削減土壤中病原菌的生物修復(fù)技術(shù)研究則相對較少。此外，現(xiàn)有研究常認(rèn)為噬菌體僅限于侵染某一“種”類的宿主細(xì)菌，而近年來學(xué)術(shù)界發(fā)現(xiàn)：一些噬菌體經(jīng)過適當(dāng)?shù)幕蚋脑旎蛉斯ぜ铀倨鋵捤拗髯V的表達(dá)，可針對同一“屬”內(nèi)幾種高度同源性的宿主細(xì)菌，甚至針對不同種屬之間的宿主細(xì)菌也具有一定廣譜性捕食區(qū)間［7-8］。這為噬菌體療法廣泛應(yīng)用奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。

本研究以南京城郊典型奶牛場牛糞堆積池塘周邊，復(fù)合病原菌污染農(nóng)田土壤為例；先從污染土壤中分離、篩選、加速其寬宿主譜表達(dá)獲得多價噬菌體；接著在水相和實際污染土壤中驗證和優(yōu)化其同步滅活多種病原菌的效果和能力，并評估修復(fù)過程中的微生物生態(tài)效應(yīng)。本研究結(jié)果可為靶向滅活農(nóng)田土壤中多種病原菌提供切實可行的生物修復(fù)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株大腸桿菌K12（Escherichia coliK12，K12）與帶紅色熒光標(biāo)記（Red Fluorescent Protein，RFP）的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PAO1），均為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤生態(tài)實驗室提供。

供試污染土壤為水稻土，采自南京市橫梁奶牛養(yǎng)殖場（32°30′45″N，118°94′7″E）牛糞堆積池附近。采用五點取樣法，取0～10 cm的表層土壤，共5 kg，混勻，于暗處4°C冷藏保存。測定土樣基本理化性質(zhì)［9］：pH 7.9，全氮1.8 g·kg-1，全磷1.1 g ·kg-1， 全 鉀 17.9 g ·kg-1， CEC 19.9 cmol·kg-1，水溶性氮1.8 g·kg-1，砂粒25.5%，壤粒45.3%，黏粒29.2%。

供試儀器與試劑為臺式低溫高速離心機、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床；大腸桿菌直接瓊脂（Escherichia coliDirect Agar，ECD瓊脂）、假單胞菌選擇性培養(yǎng)基（Pseudomonas SelectiveAgar，PSA）、SM緩沖液、Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基、環(huán)境樣品病毒核酸提取試劑盒（PowerViral Environmental RNA/DNA Isolation Kit，Mobio公司，型號28000-50）。

1.2 噬菌體的分離純化

取新鮮土壤樣品5 g，加入50 mL無菌水中，28℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)5 h，10 000 r·min-1離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜除菌，取9 mL濾液與1 mL生長到對數(shù)期的宿主菌（K12或PAO1(RFP)）懸液加入40 mL LB液體培養(yǎng)基，加氯化鈣固體至溶液終濃度1 mmol·L-1，37℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)12 h。所得培養(yǎng)液10 000 r·min-1離心5 min，再經(jīng)0.22 μm濾膜除菌，濾液即為含有噬菌體的原液［10-11］。采用雙層平板法篩選噬菌體并提純。取上述濾液100 μL與100 μL的宿主菌懸液混勻，室溫靜置15 min，加入3 mL的 0.7%LB瓊脂培養(yǎng)基，混勻后平鋪倒入LB固體平板上，37 ℃培養(yǎng)10～12 h，觀察噬菌斑。待出現(xiàn)噬菌斑，挑取單個邊緣清晰透明的噬菌斑到含有宿主菌的LB液體中，37℃、250 r·min-1培養(yǎng)8 h；10 000 r·min-1離心5 min，0.22 μm濾膜除菌，濾液保存在SM緩沖液中，于4℃冰箱冷藏保存。取上述濾液適當(dāng)稀釋培養(yǎng)并倒雙層平板驗證，如此重復(fù)4～6次即可獲得純種的噬菌體。

基于上述獲得的兩株專一型噬菌體（以K12為專一宿主的噬菌體命名為YSZ1；以PAO1（RFP）為專一宿主的噬菌體命名為YSZ5），開展加速其寬宿主譜的表達(dá)過程［12-13］。取600 μL保存的噬菌體（YSZ1或YSZ5）原液，分別與200 μL K12和200 μL PAO1(RFP)混合菌懸液，共同加入99 mL LB液體培養(yǎng)基中，再加入氯化鈣固體調(diào)至終濃度為1 mmol·L-1，37℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)96 h，每隔8 h取樣，將離心過濾獲得的新噬菌體與PAO1（RFP）和K12分別倒雙層平板驗證，觀察噬菌斑。若出現(xiàn)噬菌斑則證明表達(dá)成功，獲得多價噬菌體YSZ1R和YSZ5K，挑取單個清晰透明的噬菌斑富集儲存。

1.3 噬菌體的生物學(xué)特性鑒定

噬菌體的形態(tài)觀察，將噬菌體原液滴在銅網(wǎng)上，用pH 7.0、2%磷鎢酸負(fù)染90 s后，用濾紙吸去多余染液，干燥后于日立H-7650型透射電子顯微鏡下觀察其形態(tài)。

噬菌體核酸提取及鑒定，噬菌體核酸提取使用環(huán)境樣品病毒核酸提取試劑盒（核酸提取效率107copies·mL-1，核酸最終體積50～100 μL），提取的核酸用DNaseⅠ、RNaseⅠ和HindⅢ酶切處理并使用瓊脂糖凝膠電泳檢驗，根據(jù)酶切圖譜鑒定和判斷其核酸性狀及大小。

噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)，感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）又稱作噬菌體滴度，是指感染發(fā)生之前噬菌體與宿主菌數(shù)量的比值。最佳感染復(fù)數(shù)（Optimal multiplicity of infection，OMOI）即獲得子代噬菌體最高產(chǎn)量時的MOI。取對數(shù)期宿主菌懸液100 μL，按感染復(fù)數(shù)分別為100∶1、10∶1、1∶1、1∶100、1∶1 000、1∶10 000加入噬菌體。37℃搖床振蕩培養(yǎng)5 h。用雙層平板法測定各組噬菌體滴度1。

噬菌體一步生長曲線，按最佳感染復(fù)數(shù)，取500 μL噬菌體與500 μL宿主菌懸液加入9 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每10 min取樣，離心過濾，并用雙層平板法測定噬菌體滴度［14］。

1.4 試驗設(shè)計

噬菌體對宿主菌的滅活能力，驗證上述分離獲得的噬菌體對宿主菌的滅活能力，按照最佳感染復(fù)數(shù)添加噬菌體與宿主菌各100 μL于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)。每隔2 h取樣，每次取200 μL稀釋適當(dāng)濃度，平板計數(shù)細(xì)菌數(shù)量。每個處理同時設(shè)置單獨不添加噬菌體的對照。

噬菌體療法在水相中滅活病原菌的效果，設(shè)置水相對照組（CK），即：將K12與PAO1(RFP)培養(yǎng)到對數(shù)期后，各取100 μL加入100 mL LB液體培養(yǎng)基中，振蕩混勻，37℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)。在CK基礎(chǔ)上，綜合參考最佳感染復(fù)數(shù)，再設(shè)立4個處理：處理1：添加專一型噬菌體YSZ1；處理2：添加多價噬菌體 YSZ1R；處理3；添加專一型噬菌體 YSZ5；處理4：添加多價噬菌體YSZ5K。每種噬菌體均添加100 μL（104PFU·mL-1），每隔4 h取樣，共監(jiān)測48 h，每次取200 μL菌懸液進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)。根據(jù)細(xì)菌平板計數(shù)判斷評估噬菌體療法在水相中對病原菌的滅活效果。

噬菌體療法在污染土壤中的滅活驗證研究，為進(jìn)一步驗證噬菌體療法在實際污染土壤中滅活多種病原菌的效果，本環(huán)節(jié)將進(jìn)行逐一回接上述分離獲得的噬菌體至污染土壤中，開展修復(fù)驗證實驗。重點關(guān)注土壤中糞腸桿菌（Fecal coliform）和假單胞菌屬（Pseudomonas）菌群等病原菌的滅活效果。共設(shè)置5個實驗處理：對照組（CK）：稱250 g污染土壤，每隔8 d以無菌水調(diào)控土壤含水率至最大田間持水量的80 %，28℃±4℃，避光培養(yǎng)24 d；處理1：在對照組基礎(chǔ)上添加專一型噬菌體YSZ1；處理2：在對照組基礎(chǔ)上添加多價噬菌體YSZ1R；處理3：在對照組基礎(chǔ)上添加專一型噬菌體YSZ5；處理4：在對照組基礎(chǔ)上添加多價噬菌體YSZ5K。每組處理均添加噬菌體500 μL（104PFU·mL-1）。每隔3 d取樣，每次取5 g土壤，平板計數(shù)法測定細(xì)菌數(shù)量。使用ECD培養(yǎng)基篩選并測定糞腸桿菌群細(xì)菌數(shù)目，使用PSA培養(yǎng)基篩選并測定假單胞菌群細(xì)菌數(shù)目，每個計數(shù)濃度設(shè)3次重復(fù)。

1.5 土壤微生物群落功能的多樣性和穩(wěn)定性分析

將1.4中采集的土壤樣品，進(jìn)行微生物群落功能多樣性和穩(wěn)定性分析。土壤微生物群落功能多樣性采用Biolog ECO測定法［15-16］。Biolog ECO微平板中多底物酶聯(lián)反應(yīng)采用每孔的平均吸光度值（Average well color development，AWCD）來描述，計算表達(dá)式：

式中，C代表含底物試驗孔的吸光值，R代表不含底物對照孔的吸光值。土壤群落功能多樣性采用培養(yǎng)Biolog ECO微平板孔中吸光值，計算土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)H和辛普森指數(shù)D）。

式中，Pi為第i孔相對吸光值（C-R）與整個微平板相對吸光值總和(∑ODi)的比率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所用數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)采樣的平均值，利用軟件SPSS 21進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。圖表采用 Microsoft Excel 2016和軟件 OriginPro 9.0繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 噬菌體分離純化

經(jīng)5次分離純化及加速寬宿主譜表達(dá)后獲得四株裂性噬菌體，分別是：單一攻擊K12的噬菌體YSZ1；在YSZ1基礎(chǔ)上加速寬宿主譜表達(dá)得到能同時攻擊K12和PAO1(RFP)能力的多價噬菌體YSZ1R；單一攻擊PAO1(RFP)的噬菌體YSZ5；在YSZ5基礎(chǔ)上加速寬宿主譜表達(dá)得到能同時攻擊PAO1(RFP)和K12能力的多價噬菌體YSZ5K。由圖1可知，噬菌體YSZ1和YSZ5的噬菌斑呈清晰透明、邊緣整齊、無暈環(huán)的圓斑，直徑約1～2 mm；噬菌體YSZ1R和YSZ5K噬菌斑中間透明、四周無暈環(huán)、直徑為2～3 mm。

圖1 四株噬菌體噬菌斑形態(tài)Fig. 1 Plaques of four phages

2.2 噬菌體形態(tài)觀察

通過透射電鏡觀察不同噬菌體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)噬菌體YSZ1（圖2 A）具有清晰多面體頭部，頭長徑約95 nm，橫徑約70 nm，尾長約100 nm；YSZ1R可見到球狀頭部和一條長尾，頭長徑約60 nm，橫徑約70 nm，尾長約175 nm（圖2 B）；YSZ5可見到形狀規(guī)則的立體結(jié)構(gòu)頭部和一條長尾，頭長徑約100 nm，橫徑約70 nm，尾長約180 nm（圖2 C）；YSZ5K可見到橢圓形頭部及可收縮的尾鞘，頭長徑約110 nm，橫徑約80 nm，尾長約120 nm（圖2 D）。根據(jù)國際病毒分類委員會(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第九次報告［17］，以上四種噬菌體均屬于長尾噬菌體科。

圖2 噬菌體的透射電鏡觀察（×50.0 K）Fig. 2 Transmission electron micrographs of phage（×50.0 K）

2.3 噬菌體核酸產(chǎn)物酶切電泳分析

利用環(huán)境樣品病毒核酸提取試劑盒提取噬菌體基因組，并對核酸產(chǎn)物用酶切處理，由圖3可知，四株噬菌體均能被DNase Ⅰ 降解完全（4、8、B、F泳道），而RNase A處理核酸均無變化（3、7、C、G泳道），說明四種核酸產(chǎn)物均為雙鏈DNA［13］。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ對DNA進(jìn)行酶切處理后，估算基因組大小（2、6、D、K泳道），四株噬菌體YSZ1、 YSZ1R、YSZ5、YSZ5K基因組分別約為57 Kb、54 Kb、59 Kb和51 Kb。

2.4 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)

最佳感染復(fù)數(shù)是表征噬菌體裂解能力的重要指標(biāo)。從表1可知，當(dāng)MOI為1∶1 000時噬菌體YSZ1子代產(chǎn)出量最高，達(dá)到5.5×108PFU·mL-1，即噬菌體YSZ1的OMOI為0.001；當(dāng)MOI為10∶1時噬菌體YSZ1R子代產(chǎn)出量最高，達(dá)到1.8×108PFU·mL-1，YSZ1R的OMOI為10；當(dāng)MOI為1∶1 000時噬菌體YSZ5子代產(chǎn)出量最高，達(dá)到5.4×109PFU·mL-1，YSZ5的OMOI為0.001；當(dāng)MOI為1∶10時噬菌體YSZ5K子代產(chǎn)出量最高，達(dá)5.8×106PFU·mL-1，YSZ5K的OMOI為0.1。

圖3 噬菌體基因組酶切電泳圖Fig. 3 Electrophorogram of phages genome

表1 最佳感染復(fù)數(shù)的測定Table1 Determination of optimal multiplicity of infection (OMOI)

2.5 一步生長曲線的繪制

潛伏期是指從噬菌體侵染宿主細(xì)菌到細(xì)菌開始裂解時為止的周期；爆發(fā)期是指從細(xì)菌裂解開始到所有被感染細(xì)菌完全裂解的周期；裂解量=爆發(fā)末期噬菌體滴度/感染初期宿主細(xì)菌數(shù)量［18］。YSZ1感染宿主菌的潛伏期為13 min，爆發(fā)期為47 min，裂解量為365（圖4 A）；YSZ1R感染宿主菌的潛伏期為20 min，爆發(fā)期為51 min，裂解量為47（圖4 B）；YSZ5感染宿主菌的潛伏期為12 min，爆發(fā)期為49 min，裂解量為418（圖4 C）；YSZ5K感染宿主菌的潛伏期為18 min，爆發(fā)期為42 min，裂解量為24（圖4 D）。由此可知，四株噬菌體的潛伏期和爆發(fā)期相對較短，具有潛在的修復(fù)應(yīng)用價值。

2.6 專一型噬菌體對單一宿主菌的滅活能力

對上述分離得到的兩株專一型裂解性噬菌體在水相中進(jìn)行滅活能力驗證實驗。由圖5 A可知，單獨添加噬菌體YSZ1，能顯著抑制K12生長（P＜0.05）；相較于對照組K12的生長曲線，添加噬菌體YSZ1培養(yǎng)12 h后，K12數(shù)量下降至8.9個數(shù)量級。此外，由圖5 B可知，YSZ5對PAO1(RFP)也具有顯著的滅活作用（P＜0.05），相較于對照組PAO1(RFP)的生長曲線，添加噬菌體YSZ5培養(yǎng)12 h后，PAO1(RFP)下降至9.2個數(shù)量級。

圖4 噬菌體一步生長曲線Fig. 4 One step growth curve of phage

圖5 噬菌體滅活能力Fig. 5 Inactivation ability of phage

2.7 水相中檢驗噬菌體療法滅活混合病原菌的效果

為了探究噬菌體靶向滅活病原菌的能力，本研究將上述獲得的四株噬菌體添加到K12和PAO1(RFP)的混合菌液中，并測定其細(xì)菌數(shù)量衰減變化。由圖6 A可知，專一型噬菌體YSZ1對K12的滅活效果非常顯著（P＜0.05），與原始CK相比，K12下降約1.5個數(shù)量級；而PAO1(RFP)呈現(xiàn)先快速增長，28 h后再緩慢下降的趨勢，下降了約0.5個數(shù)量級，這可能是由于專一型噬菌體YSZ1在混合病原菌體系中，優(yōu)先攻擊K12宿主菌，隨著共培養(yǎng)的自然進(jìn)化過程，逐漸形成并具備了一定攻擊PAO1(RFP)的能力［12］。處理2（圖6 B）中添加了多價噬菌體YSZ1R之后，K12生長抑制率相較于圖6 A結(jié)果略有下降，下降了約1.1個數(shù)量級；而PAO1(RFP)生長抑制率則相較于圖6 A結(jié)果出現(xiàn)一定程度的上升，整體下降了約1.0個數(shù)量級。處理3（圖6 C）中，添加了專一型噬菌體YSZ5之后，PAO1(RFP)數(shù)量呈現(xiàn)顯著下降的趨勢（P＜0.05），下降了約1.9個數(shù)量級，同樣K12在0～24 h期間出現(xiàn)穩(wěn)定增長后，呈下降趨勢，截止48 h時，共下降了約0.4個數(shù)量級，這可能是由于隨混合體系中宿主密度增加噬菌體的同時具備較高的吸附速率，其中部分YSZ5噬菌體也進(jìn)化出攻擊K12的廣譜滅活能力［12,19］。處理4（圖6 D）中，多價噬菌體YSZ5K對K12和PAO1(RFP)的協(xié)同滅活效果相較于其他三組處理，最為顯著（P＜0.05），K12下降約1.0個數(shù)量級，PAO1(RFP)下降約1.7個數(shù)量級。由此可知，多價噬菌體YSZ5K相對其他種類噬菌體滅活效果具有更加廣譜性的捕食范圍，可為后續(xù)靶向滅活污染土壤中復(fù)合病原菌的修復(fù)技術(shù)研發(fā)，提供高效的噬菌體菌種資源。

圖6 混合菌懸液中不同種噬菌體滅活效果Fig. 6 Inactivation effect of different phages in mixed bacteria suspension

2.8 噬菌體療法滅活污染土壤中復(fù)合病原菌的驗證研究

在病原菌復(fù)合污染土壤中，病原菌豐度的變化是決定土壤污染程度和修復(fù)效果的重要參考。本研究中使用的土壤樣品采集自奶牛場牛糞堆積池附近的污染土壤，其中多種病原菌的背景豐度較高，在培養(yǎng)24 d時，糞腸桿菌（Fecal coliform）細(xì)菌豐度為8.2×106CFU·mL-1，假單胞菌屬（Pseudomonas）細(xì)菌豐度為6.8×105CFU·mL-1（圖7 A）。在第24天時，處理1中專一型噬菌體YSZ1對土壤中糞腸桿菌系列病原菌的滅活效果高于假單胞菌屬的相應(yīng)滅活效果。在該處理中，糞腸桿菌細(xì)菌豐度下降至8.7×105CFU·mL-1，而假單胞菌屬細(xì)菌豐度下降至6.1×104CFU·mL-1，這一結(jié)果可能是由于在實際污染土壤中，YSZ1也逐漸進(jìn)化出針對PAO1的協(xié)同滅活能力［12］；處理2（圖7 B）中，多價噬菌體YSZ1R對兩類病原菌都有明顯的滅活能力（P＜0.05），糞腸桿菌細(xì)菌豐度下降至9.6×105CFU·mL-1，假單胞菌屬細(xì)菌豐度下降至3.2×104CFU·mL-1；處理3（圖7 C）中，專一型噬菌體YSZ5對于假單胞屬細(xì)菌的滅活效果呈現(xiàn)整體呈下降趨勢，在第24天時已下降至1.8×104CFU·mL-1，而對于糞腸桿菌細(xì)菌的滅活影響，則呈現(xiàn)出0～15 d之內(nèi)略有升高，第15天后逐漸下降，第24天下降至2.2×106CFU·mL-1；處理4（圖7 D）中，添加了多價噬菌體YSZ5K之后，糞腸桿菌細(xì)菌和假單胞屬細(xì)菌豐度均呈現(xiàn)下降的趨勢，第24天，糞腸桿菌細(xì)菌豐度下降至6.5×105CFU·mL-1；假單胞屬細(xì)菌豐度下降至1.2×104CFU·mL-1。多價噬菌體（YSZ1R/YSZ5K）對污染土壤中復(fù)合病原菌綜合協(xié)同滅活能力均顯著高于專一型噬菌體（YSZ1/YSZ5），并且噬菌體YSZ5K在實際污染土壤中的滅活效果要大于噬菌體YSZ1R的相應(yīng)滅活效果。上述滅活土壤中復(fù)合病原菌的效果趨勢與水相中相關(guān)驗證結(jié)果規(guī)律一致，盡管滅活土壤中病原菌群的效果略低于純水相中的效果，這可能是由于實際污染土壤中不僅存在復(fù)合病原菌群，同樣也存在大量益生菌群，抵消或削減了實際土壤滅活修復(fù)的效果［20-21］。然而，該結(jié)果仍然對于靶向修復(fù)高豐度病原菌污染土壤具有顯著的指示意義。

圖7 污染土壤中糞腸桿菌和假單胞菌屬細(xì)菌豐度的動態(tài)變化Fig. 7 Dynamic of fecal coliform and Pseudomonas bacterial abundance in contaminated soil

2.9 噬菌體療法對土壤微生物群落多樣性的影響

噬菌體療法在靶向滅活土壤中復(fù)合病原菌的同時，可能也會對土壤其他益生菌群或整體微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性造成一定程度的影響［22］。因此，對施用過噬菌體療法的污染土壤進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險評估十分必要。AWCD數(shù)值的變化可以反映土壤微生物整體代謝活性的波動；香農(nóng)豐富度指數(shù)H反映的是群落的豐富度, 其值越大說明群落多樣性越高；辛普森優(yōu)勢度指數(shù)D可反映土壤微生物群落常見種的優(yōu)勢度變化, 數(shù)值越大表明得到同一物種的幾率越大, 其微生物多樣性越低。

如圖8所示，0～120 h 內(nèi)AWCD值快速增長，進(jìn)入對數(shù)增長期；在培養(yǎng)的120 h后，AWCD值隨培養(yǎng)時間的延長趨于緩慢并達(dá)到穩(wěn)定。AWCD值在0.1～0.7之間，AWCD值表現(xiàn)為YSZ5K＞YSZ1R＞CK＞YSZ5＞YSZ1。

此外，從表2可知，不同處理之間，多價噬菌體的豐富度指數(shù)H顯著高于單一性噬菌體的豐富度指數(shù)，而優(yōu)勢度指數(shù)D則為多價噬菌體處理顯著低于專一型噬菌體處理（P＜0.05）。在這些指數(shù)的變化過程中均具有類似規(guī)律，即分別單獨添加多價噬菌體YSZ5K處理和YSZ1R處理，均可在一定程度上顯著促進(jìn)修復(fù)后土壤微生物功能多樣性和穩(wěn)定性（P＜0.05），而分別單獨添加專一型噬菌體YSZ5處理和YSZ1處理，土壤微生物多樣性出現(xiàn)了一定程度的降低。

由此說明，多價噬菌體療法對于維持或改善土壤微生物群落代謝活性具有一定的良性作用；而專一型的裂解性噬菌體對于土壤微生物群落代謝活性的影響，則存在一定負(fù)面風(fēng)險。這可能是由于多價噬菌體的捕食范圍較廣，其自身進(jìn)化和拓展捕食宿主細(xì)菌的能力較強，因而有助于提升土壤微生物群落的多樣性和穩(wěn)定性。相反專一型宿主噬菌體在實際污染土壤環(huán)境中靶向滅活宿主菌的專屬性過強，則有可能導(dǎo)致某一屬種的宿主細(xì)菌大幅度滅活，致使土壤微生物群落系統(tǒng)中某一類細(xì)菌出現(xiàn)生態(tài)位的缺失，造成土壤微生物群落代謝活性降低的短期現(xiàn)象。因而，在實際噬菌體療法的應(yīng)用中，使用多價噬菌體同步滅活多種病原菌的技術(shù)具有廣譜性高、生態(tài)風(fēng)險低、環(huán)境友好的優(yōu)點。

圖8 不同處理方式下AWCD值的變化Fig. 8 Variation of AWCD value relative to different treatment

表2 不同處理方式土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indices of soil microbial communities relative to different treatment

3 結(jié) 論

針對當(dāng)前病原菌復(fù)合污染土壤的環(huán)境問題，本研究提出了基于噬菌體療法靶向滅活土壤中多種病原菌的修復(fù)技術(shù)。研究分離篩選出的多價噬菌體在水相和實際污染土壤中同步滅活糞腸桿菌和假單胞菌屬細(xì)菌的能力顯著高于專一型噬菌體的相應(yīng)滅活能力，同時使用多價噬菌體療法也有助于維護(hù)和改善修復(fù)后土壤微生物生態(tài)功能多樣性與穩(wěn)定性。