高永平*

(信陽(yáng)學(xué)院理工學(xué)院應(yīng)用生物化學(xué)研究所，河南信陽(yáng) 464000)

圖1 DPPIPE結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of DPPIPE

醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，隨著社會(huì)的發(fā)展和人們生活條件的提高，肥胖問(wèn)題對(duì)人們工作和生活的影響凸顯。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟預(yù)計(jì)，到2035年全球糖尿病患者將達(dá)到5.92億[1]。研究發(fā)現(xiàn)，膳食脂肪酸是造成糖尿病發(fā)病的重要因素之一。目前檢測(cè)脂肪酸的方法多種多樣，但或多或少存在不足和缺陷。常用的如重氮甲烷類試劑和溴代香豆素類化合物[2 - 3]，不足之處是對(duì)水、潮氣不穩(wěn)定，需要在無(wú)水環(huán)境中進(jìn)行；溴甲基類化合物和NOEPES磺酸酯對(duì)脂肪酸類化合物[4 - 5]，缺陷之處是衍生過(guò)程需借助催化劑，并且分離前還需要預(yù)處理,費(fèi)時(shí)費(fèi)力。胡娜等[6]采用2-(11-H-苯-a-咔唑)乙基對(duì)甲苯磺酸酯對(duì)脂肪酸類化合物進(jìn)行了測(cè)定,但存在衍生化過(guò)程溫度高，樣品色譜分離所需時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。柱前衍生結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測(cè)法，因其優(yōu)越的選擇性和靈敏度，已發(fā)展為一種行之有效的檢測(cè)手段[7 - 8]。

本文采用高靈敏度熒光試劑1-[1-(哌嗪)乙酮]-2-[(4-二甲氨基)苯基]-菲[9,10-d]咪唑(DPPIPE)作為柱前衍生化試劑(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)，對(duì)8種混合脂肪進(jìn)行衍生，衍生物采用高效液相色譜-熒光法測(cè)定實(shí)現(xiàn)了樣品中混合脂肪酸衍生物分離分析，并對(duì)人體血漿中微量脂肪酸實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單、靈敏、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)，Agilent公司)，采用大氣壓化學(xué)電離源(APCI)，附Agilent 1100離子阱，配備四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、在線真空脫氣機(jī)和熒光檢測(cè)器。

DPPIPE(自制)，哌嗪(分析純)，N,N′-羰基二咪唑(CDI，分析純)，4-二甲基胺吡啶(DMAP，分析純),乙腈(ACN，光譜純)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF,色譜純)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二甲胺鹽酸鹽(EDC，分析純)。18種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(美國(guó)Sigma公司)：乙酸(C2)；丙酸(C3)；正丁酸(C4)；戊酸(C5)；己酸(C6)；庚酸(C7)；辛酸(C8)；壬酸(C9)；癸酸(C10)；十一酸(C11)；十二酸(C12)；8，11，14-十八碳三烯酸(C18∶3)；十四酸(C14)；9，12-十八碳二烯酸(C18∶2)；十六酸(C16)；12-十八碳烯酸(C18∶1)；十八酸(C18)；二十酸(C20)。

血漿樣品由信陽(yáng)中心醫(yī)院血液檢測(cè)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)際樣品處理在離心管中依次加入血漿樣品100 μL，2 mL磷酸鹽緩沖液(pH=6.5)，用6 mL氯仿-正己烷(體積比1∶1)分2次萃取，離心，合并上清液，用2 mL乙腈振蕩溶解，備用。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別定量稱取8種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成2.0×10-2mol·L-1的溶液(長(zhǎng)鏈脂肪酸可加適量DMF助溶)。準(zhǔn)確稱量27.15 mg DPPIPE，用DMF配制成10 mL 5.0×10-2mol·L-1溶液。低濃度的衍生試劑(5.0×10-3mol·L-1)和脂肪酸(1.0×10-4mol·L-1)的標(biāo)準(zhǔn)液分別用DMF、乙腈稀釋而成。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)品的衍生向2 mL安培瓶中，依次加入100 μL EDC，100 μL DMAP，100 μL(5.0×10-3mol·L-1)衍生試劑，50 μL 2.0×10-4mol·L-1的脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品，100 μL乙腈，密封65 ℃恒溫水反應(yīng)1 h，自然冷卻后，直接進(jìn)樣分析。衍生反應(yīng)見(jiàn)圖2。

圖2 DPPIPE與脂肪酸衍生反應(yīng)圖Fig.2 Scheme showing the derivatization of DPPIPE with fatty acids

1.2.4色譜與質(zhì)譜條件Hypersil BDS C-8色譜柱(150×4.6 mm i.d.,5 μm；大連依立特公司)。流動(dòng)相A：50%乙腈水溶液，B：100%乙腈。梯度條件：0～30 min，A由60%到0，B由40%到100%。流動(dòng)相流速為1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。最大激發(fā)波長(zhǎng)：260 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)：430 nm。正離子模式，干燥氣流量：9 L·min-1，干燥氣溫度：350 ℃，噴霧壓力：35 psi，電暈電流：4 000 μA(Pos)，毛細(xì)管電壓：3.5 kV。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生條件的優(yōu)化

DPPIPE與脂肪酸的衍生化效率，隨試劑倍數(shù)(衍生試劑量與標(biāo)準(zhǔn)品量的比值)、催化劑/縮合劑、衍生時(shí)間、衍生溫度的不同存在顯著差異。本實(shí)驗(yàn)選取C12、C14、C18∶2、C18∶1、C20，考察了試劑倍數(shù)(2、4、6、8、10倍)對(duì)衍生化效率的影響，結(jié)果表明試劑倍數(shù)為6時(shí)衍生化產(chǎn)率最高，而隨著試劑倍數(shù)的增大衍生化效率反而降低，可能原因是隨著衍生試劑倍數(shù)的增大，過(guò)多的衍生試劑覆蓋了標(biāo)準(zhǔn)品，導(dǎo)致被覆蓋的標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)法充分進(jìn)行衍生反應(yīng)。同樣對(duì)其他影響因素進(jìn)行了考察，結(jié)果表明：EDC和DMAP均取100 μL，衍生時(shí)間為1 h，衍生溫度為65 ℃時(shí)最佳。

2.2 高效液相色譜分離

依照上述優(yōu)化條件，本文選取C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C18∶3、C14、C18∶2、C16、C18∶1、C18、C20共計(jì)18種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行衍生化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C2～C11短鏈的脂肪酸衍生物色譜峰與衍生試劑峰重疊，因而選取對(duì)C12～C20這8種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行衍生化并進(jìn)行定性定量分析，結(jié)果顯示：26 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)8種目標(biāo)脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的基線分離，見(jiàn)圖3。

2.3 線性回歸方程、檢出限和重現(xiàn)性

在相同條件下，對(duì)上述8種目標(biāo)脂肪酸進(jìn)行分析測(cè)定，各脂肪酸衍生物的回歸方程、檢出限和相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)表1相關(guān)數(shù)據(jù)。按照峰面積(y)、實(shí)際進(jìn)樣量(x)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示：各脂肪酸衍生物的線性范圍：4.40～13.75 pmol，相關(guān)系數(shù)范圍：0.9986～0.9999，檢出限(信噪比S/N=3)為0.290～0.593 pmol；峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<0.5749%；保留時(shí)間的RSD<3.767%。

表1 脂肪酸衍生物線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢測(cè)限和精密度(RSD)

圖3 標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸衍生物總離子流(TIC)色譜圖Fig.3 TIC chromatograms for standard fatty acid derivatives The number of peaks are the same as Table 1.

圖4 血漿樣品中脂肪酸衍生物的色譜分離圖Fig.4 Chromatogram of fatty acid derivatives from plasma The number of peaks are the same as Table 1.

2.4 回收率和實(shí)際樣品的測(cè)定

血漿樣品按照實(shí)驗(yàn)方法處理，并按照優(yōu)化條件衍生，得到各脂肪酸的回收率范圍為98.72%～101.9%。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，得到人體血漿樣品中脂肪酸衍生物的色譜分離圖(圖4)以及各脂肪酸的測(cè)定結(jié)果(表2)。

表2 實(shí)際樣品中脂肪酸的測(cè)定結(jié)果(n=6)

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3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以自制熒光探針DPPIPE作為柱前衍生試劑，采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)技術(shù),通過(guò)對(duì)衍生以及色譜條件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了8種脂肪酸的分離分析，并對(duì)人體血漿中脂肪酸的含量進(jìn)行了測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)對(duì)相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)理的研究，疾病診斷以及其預(yù)防提供有益參考。