張為家,蘇小巖,李 爽,曾 海,2△

(1.長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，湖北荊州 434000;2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤放化療科，武漢 430071)

卵巢癌發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第三位，病死率高居第一位，全球每年因卵巢癌死亡的患者約14萬[1]。卵巢癌起病隱匿、早期癥狀不典型，使得多數(shù)卵巢癌患者確診時已為晚期，手術(shù)難以徹底清除腫瘤病灶。以鉑類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是晚期卵巢癌的一線治療方式，然而多數(shù)患者在化療過程中產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，這是卵巢癌治療失敗的重要原因之一[2-3]。因此，探索卵巢癌順鉑耐藥的分子機(jī)制成為卵巢癌研究的難點與熱點。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞在內(nèi)外因素刺激下轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)表型的生物學(xué)過程。最新研究表明，EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤干細(xì)胞形成及腫瘤耐藥等多種惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[4-5]。目前，關(guān)于卵巢癌順鉑耐藥與EMT之間的關(guān)系研究較少。本研究建立卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株，比較耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞表型差異；另外體外誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT，觀察對順鉑化療敏感性的影響，以期探討EMT與卵巢癌細(xì)胞順鉑化療耐藥間的關(guān)系，為闡明卵巢癌順鉑耐藥提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及試劑 人卵巢癌細(xì)胞株A2780、OVCAR3購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所；新型甲胺化合物(MTS)、順鉑及轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)購自美國Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自廣州英韋創(chuàng)津公司；Transwell小室購自美國Millipore公司；鼠抗人E-cadherin、vimentin、免疫熒光標(biāo)記二抗和羊抗鼠IgG-HRP二抗購自美國Cell Signaling公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及順鉑耐藥細(xì)胞株的建立 A2780、OVCAR3細(xì)胞用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基于37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過順鉑間歇誘導(dǎo)和大劑量沖擊相結(jié)合的方法建立順鉑耐藥的人卵巢癌細(xì)胞株A2780/DDP、OVCAR3/DDP[6]。耐藥細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為5 μmol/L順鉑維持耐藥表型，撤藥培養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

1.2.2MTS實驗 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按每孔3 000個接種到96 孔板，待培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后加入濃度為0.1、1.0、10.0、20.0、40.0、80.0及100.0 μmol/L的順鉑。培養(yǎng)72 h后加入MTS (5 g/L)每孔20 μL，孵育2 h，于酶標(biāo)儀上測定波長490 nm吸光度值(A490)。每孔重復(fù)3次。由A值計算出各藥物濃度處理組的生存率，依據(jù)藥物濃度與其生存率繪制量效曲線圖。

1.2.3Transwell細(xì)胞遷移實驗 在Transwell的聚偏氟乙烯(PVDF)膜的外表面涂一層fibronectin (10 μg/mL，50 μL) ， 37 ℃孵育2 h后放入每孔加有600 μL培養(yǎng)基的24孔板內(nèi)，在Transwell的內(nèi)室加入細(xì)胞濃度為2×105個/mL細(xì)胞懸液200 μL，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育48 h，取出Transwell小室，用棉簽擦去內(nèi)室面未遷移細(xì)胞，4.0%甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下挑取10個高倍視野計數(shù)，重復(fù)3次。

1.2.4Transwell細(xì)胞侵襲實驗 將基質(zhì)膠鋪于小室底部，小室下層加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液500 μL，上層加入無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液100 μL。制備細(xì)胞懸液，上室加入細(xì)胞濃度為2×105個/mL細(xì)胞懸液200 μL，培養(yǎng)48 h，染色和計數(shù)方法同遷移實驗。

1.2.5Western blot檢測 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入含cocktail蛋白酶抑制劑的RAPI蛋白裂解液冰上裂解30 min；吸取裂解混合液離心取上清液即為細(xì)胞總蛋白。測定總蛋白濃度后按每孔50 μg進(jìn)行10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜后以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入稀釋后的一抗 4 ℃孵育過夜，PBST洗滌后加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，ECL底物顯色。

1.2.6免疫熒光檢測 制備細(xì)胞爬片，以4.0%冷的多聚甲醛室溫固定30 min，0.1%曲拉通透化2～5 min，2.0% BSA室溫封閉60 min。加入稀釋的E-cadherin單克隆抗體4 ℃孵育過夜，加入稀釋的熒光標(biāo)記二抗于37 ℃孵育1 h。5 μg/mL DAPI染色2 min，抗淬滅封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.7TGF-β體外誘導(dǎo) 用5 ng/mL TGF-β體外誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞A2780發(fā)生48 h后EMT改變，檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力及EMT標(biāo)記物表達(dá)以驗證EMT表型。

2 結(jié) 果

2.1卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的鑒定 MTS結(jié)果顯示,A2780/DDP的IC50值為(71.86±6.52)μmol/L，A2780的IC50值(7.50±0.98) μmol/L，IC50值升高9.58倍(χ2=15.495，P<0.01)；OVCAR3/DDP、OVCAR3的IC50值分別為(61.75±7.28)、 (4.68±1.18) μmol/L，IC50值升高13.19倍(χ2=19.318，P<0.01)。

2.2卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥形態(tài)學(xué)觀察及遷移、侵襲能力檢測 A2780/DDP、OVCAR3/DDP發(fā)生了形態(tài)學(xué)改變，具有間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點，細(xì)胞變得狹長、呈紡錘形、伸出偽足、細(xì)胞之間疏散，見圖1。Transwell細(xì)胞遷移、侵襲實驗結(jié)果顯示A2780/DDP、OVCAR3/DDP細(xì)胞遷移及侵襲能力均明顯高于親本細(xì)胞A2780、 OVCAR3，見圖2。

A：A2780;B：A2780/DDP;C:OVCAR3;D:OVCAR3/DDP

圖1 卵巢癌親本細(xì)胞及耐藥細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異(×200)

2.3卵巢癌親本細(xì)胞與順鉑耐藥細(xì)胞EMT標(biāo)記物E-cadherin、Vimentin表達(dá) A2780/DDP、OVCAR3/DDP中上皮分子標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)缺失，而間充質(zhì)分子標(biāo)志物Vimentin表達(dá)明顯上調(diào)，見圖3。親本細(xì)胞A2780、OVCAR3中E-cadherin位于細(xì)胞膜，表達(dá)量高；耐藥細(xì)胞A2780/DDP、OVCAR3/DDP細(xì)胞膜上未見E-cadherin的表達(dá)，見圖4。

圖2 卵巢癌親本細(xì)胞及耐藥細(xì)胞遷移和侵襲能力比較

圖3 卵巢癌親本細(xì)胞及耐藥細(xì)胞中E-cadherin和

2.4TGF-β體外誘導(dǎo)對卵巢癌細(xì)胞的影響 TGF-β處理的A2780細(xì)胞遷移、侵襲能力明顯高于對照組，且E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)、Vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)。MTS結(jié)果顯示，TGF-β體外誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞A2780發(fā)生EMT改變后，細(xì)胞的IC50值由(7.50±0.68) μmol/L上升為(37.56±3.28) μmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.956，P<0.01)，見圖5。

圖4 卵巢癌親本細(xì)胞及順鉑耐藥細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)及定位(×400)

A:細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(×200)；B：Western blot檢測E-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá);C:Transwell遷移及侵襲實驗;Con：PBS處理對照組；TGF-β：TGF-β處理組

圖5 TGF-β體外誘導(dǎo)對卵巢癌細(xì)胞的影響

3 討 論

鉑類為主的聯(lián)合化療治療卵巢癌患者的首次有效率為70%～80%，但80%以上患者2～3年后對鉑類產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥[7]。耐藥細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移特性，晚期卵巢癌患者常死于鉑類耐藥后的廣泛轉(zhuǎn)移，使其5年生存率僅為46%左右[8]。尋找卵巢癌鉑類化療耐藥的機(jī)制一直是腫瘤學(xué)界研究的熱點。越來越多的證據(jù)表明，EMT是將腫瘤轉(zhuǎn)移與耐藥聯(lián)系起來的關(guān)鍵因素，而抑制腫瘤細(xì)胞EMT或可同時抑制腫瘤細(xì)胞的耐藥與侵襲能力[9-11]。但目前尚缺乏EMT參與卵巢癌鉑類耐藥的研究證據(jù)。

EMT 是指在特定生理病理條件下，上皮細(xì)胞失去極性，轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細(xì)胞，并獲得侵襲和遷移能力的過程[12]。研究發(fā)現(xiàn)，EMT與多種惡性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和食管癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，EMT成為近年來抗腫瘤研究領(lǐng)域的熱點之一[13-14]。E-cadherin的表達(dá)減少是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間黏附能力降低，遷移活動能力增強(qiáng)，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[15]。Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞的重要標(biāo)記物之一，可使細(xì)胞黏著斑的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，增加腫瘤細(xì)胞的黏附與遷移能力[16]。本研究顯示，A2780/DDP、OVCAR3/DDP細(xì)胞形態(tài)發(fā)生長梭形改變；進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)E-cadherin的表達(dá)明顯下調(diào)，而Vimentin的表達(dá)明顯上調(diào)；Transwell細(xì)胞遷移、侵襲實驗進(jìn)一步證實了耐藥細(xì)胞的侵襲能力明顯增加。上述研究結(jié)果符合EMT 過程中的分子生物學(xué)特征。為進(jìn)一步明確EMT與卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的關(guān)系，本實驗從反方面以TGF-β誘導(dǎo)處理卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT后，檢測出對順鉑的生長抑制作用明顯降低。以上研究結(jié)果高度提示EMT可能為卵巢癌順鉑耐藥監(jiān)測及逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的潛在靶點。

目前有研究發(fā)現(xiàn)，順鉑耐藥的非小細(xì)胞肺癌獲得典型的EMT表型，細(xì)胞膜蛋白E-cadherin表達(dá)缺失、Vimentin的表達(dá)增加，細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增加[17]。有報道順鉑耐藥的胃癌細(xì)胞通過CIP2A/PP2A/AKT信號軸發(fā)生EMT改變，另外報道順鉑耐藥的頭頸部腫瘤細(xì)胞獲得典型的EMT 特征,CD44分子通過microRNA-200c/ZEB-1參與其調(diào)節(jié)[18-19]。以上研究提示EMT 與多種上皮源性腫瘤細(xì)胞對順鉑化療耐藥密切相關(guān)，EMT能否成為臨床鉑類耐藥的有效預(yù)測分子，有待更多其他類型腫瘤及臨床組織病理學(xué)驗證。多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與EMT的發(fā)生，與TGF-β、Wnt/β-catenin、 zeb-1/Snail/Slug/Twist轉(zhuǎn)錄因子，MiRNA及LncRNA調(diào)控機(jī)制、微環(huán)境等因素有關(guān)[20-21]。本研究中卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥發(fā)生EMT的信號調(diào)控機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究從卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株發(fā)生EMT改變與誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT對化療敏感性降低兩個角度證實了EMT與卵巢癌順鉑耐藥密切相關(guān)，為未來監(jiān)測卵巢癌順鉑耐藥、逆轉(zhuǎn)耐藥的治療提供新的研究策略。