曾 珠，何成詩，孫劍峰，劉 磊，楊秀麗，肖 瑋

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,成都 610075;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，成都 610072)

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，隨著環(huán)境污染及社會、經(jīng)濟等因素的影響，肺癌的發(fā)病率和病死率逐年升高。國家癌癥中心2018年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，我國男性肺癌發(fā)病率及病死率均排名第一，我國女性肺癌發(fā)病率排名第二，病死率排名第一[1]。目前國內(nèi)外研究表明，對于肺癌的治療依然首選手術(shù)，但對大多數(shù)患者來說就診時已屬于中晚期肺癌，失去了手術(shù)機會，而放、化療已成為其治療中不可或缺的重要手段，但其對人體毒副作用大，長期使用降低腫瘤細胞對其敏感性的缺點限制了臨床療效。中藥具有減輕放、化療毒副作用，改善腫瘤細胞耐藥性，增強抗腫瘤作用的重要特點[2]。白花蛇舌草為茜草科植物的全草，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草在體內(nèi)外均有抗腫瘤作用，其主要作用機制包括抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，增強免疫功能，抑制侵襲和腫瘤細胞的多耐藥性等。本實驗通過研究白花蛇舌草作用于A549肺癌干細胞，探討其對肺癌干細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響，進一步闡明其抗腫瘤可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株人肺癌A549細胞系購于上海中國科學(xué)院細胞庫。

1.1.2主要試劑與儀器 白花蛇舌草(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房)；DMEM培養(yǎng)、胎牛血清(美國Gibco公司)；青霉素-鏈霉素溶液100×(碧云天公司)；CD133抗體(美國RD公司)；CCK-8試劑盒(美國Sigma公司)；Annexin V-PE/7-AAD流式試劑盒(美國BD公司)；一抗Anti Sox2、Anti Oct4(兔來源，美國Abcam公司)；Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit(美國BD公司)；低速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；倒置顯微鏡、照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)；流式細胞檢測儀(美國BD公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將人肺癌A549細胞培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，2～3 d換液1次，細胞80%融合度時傳代，可按照1∶3傳代比例進行，于37 ℃ 5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2A549肺癌干細胞誘導(dǎo) 取對數(shù)生長期的A549細胞，以1×103個/mL的密度接種到6孔板中，用無血清干細胞培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基+4 U/L胰島素+1X B27+20 ng/mL EGF+20 ng/mL bFGF)懸浮培養(yǎng)，隔1～2 d更換培養(yǎng)基，2～3周后可見腫瘤細胞球形成，傳代用于后續(xù)實驗。

1.2.3流式細胞檢測CD133表達 取對數(shù)生長期的A549細胞，接種到6孔板中，待細胞生長達到60%～70%用0.25%胰酶消化細胞，離心后用PBS重懸細胞，在每個流式檢測管或板式微孔中加入50 μL的稀釋后的抗體(抗體用Staining Buffer稀釋成合適的濃度)。在空白管/孔中加入50 μL Staining Buffer，在各管/孔中分別加入50 μL細胞懸液，常溫孵育30 min后加入Staining Buffer(每個流式檢測管中加2 mL，而每微孔中加200 μL)，離心后重復(fù)洗滌3次，100 μL重懸細胞后上流式儀檢測[3-6]。

1.2.4免疫組織化學(xué)檢測Sox2、Oct4表達 將細胞消化后，用完全培養(yǎng)基重懸調(diào)整細胞密度至2×104個/mL，取細胞懸液滴在無菌的12孔板中鋪上的細胞爬片上，30 min后在培養(yǎng)皿中補加完全培養(yǎng)液放于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用PBS漂洗2次后用4%多聚甲醛固定，再分別經(jīng)0.5%Triton X-100處理(室溫)60 min、3% H2O2處理(室溫)15 min，處理前后均用PBS洗滌3次。山羊血清室溫封閉60 min，取出甩干封閉液(不漂洗)，一抗孵育(稀釋比1∶200)4 ℃過夜，陰性對照用PBS液代替一抗，PBS清洗標(biāo)本3次各5 min，二抗(生物素標(biāo)記)工作液孵育37 ℃ 30 min，PBS清洗標(biāo)本3次各5 min，堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液(濕盒)37 ℃ 30 min，PBS清洗標(biāo)本3次各5 min，DAB顯色(避光，鏡下觀察至棕色)，再用蘇木素復(fù)染，自來水洗返藍，梯度乙醇脫水后封片至鏡下觀察[7-8]。

1.2.5CCK-8檢測細胞增殖 取正常生長的A549細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，每組細胞設(shè)9個復(fù)孔，將96孔板移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃ 5% CO2)，培養(yǎng)24 h后實驗組按白花蛇舌草提取物0.5 g/mL加入細胞中，分別培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液(注意不要產(chǎn)生氣泡)，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，同時設(shè)置空白孔(培養(yǎng)基、CCK-8)、對照孔(未經(jīng)處理的細胞、培養(yǎng)基、CCK-8)，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度值(A值)[9]。細胞活力(%)=[A(實驗組)-A(空白組)]/[A(對照組)-A(空白組)]×100%，細胞抑制率(%)=[A(對照組)-A(實驗組)]/A(對照組)×100%。

1.2.6流式細胞檢測細胞凋亡和周期 將A549細胞用6孔板培養(yǎng)，待細胞生長達到60%～70%，對照組加入DMEM培養(yǎng)基，實驗組加入白花蛇舌草提取物1 g/mL，胰酶消化收集細胞，用 PBS洗滌細胞2次。在50 μL的Binding Buffer中加入5 μL 7-AAD染液混勻，室溫、避光并反應(yīng)5～15 min后再加入450 μL的Binding Buffer混勻，加入1 μL AnnexinV-PE混勻室溫、避光、反應(yīng)5～15 min，1 h內(nèi)進行流式細胞儀的觀察和檢測。用70%乙醇4 ℃固定2 h或更長時間。檢測前 PBS沖洗細胞 1次，加入0.5 mL碘化丙啶染色液，37 ℃避光溫浴30 min。隨后4 ℃或冰浴避光存放，24 h內(nèi)用流式細胞儀在激發(fā)488 nm波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。

2 結(jié) 果

2.1細胞中CD133表達情況 A549肺癌干細胞中CD133陽性率(70.483 30±0.092 92)%，A549細胞中僅為(5.056 70±0.185 83)%，經(jīng)傳代培養(yǎng)后誘導(dǎo)形成的細胞球富含肺癌干細胞。

2.2細胞中Sox2、Oct4表達情況 通過免疫組織化學(xué)檢測出Sox2、Oct4表達在A549細胞及A549肺癌干細胞中均呈陽性，主要在細胞質(zhì)中表達，在A549肺癌干細胞中染色強度更強，見圖1～3。在視野為200倍的高倍鏡下選取10個視野求平均陽性細胞率，Sox2在A549細胞及A549肺癌干細胞中的陽性細胞率分別為63.33%、86.67%，Oct4陽性細胞率分別74.30%、84.30%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

A：A549細胞(×200)；B：A549細胞(×400)；C：A549肺癌干細胞(×200)；D：A549肺癌干細胞(×400)

圖1 DAB免疫組織化學(xué)染色檢測Sox2表達

A：A549細胞(×200)；B：A549細胞(×400)；C：A549肺癌干細胞(×200)；D：A549肺癌干細胞(×400)

圖2 DAB免疫組織化學(xué)染色檢測Oct4表達

A:×200;B:×400

圖3 陰性對照免疫組織化學(xué)檢測

2.3白花蛇舌草對A549肺癌干細胞增殖的影響 空白組各時間點A值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其余兩組在不同時間點A值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，實驗組A值較對照組低(P<0.05)，見表1。白花蛇舌草作用于肺癌干細胞24、48、72 h對細胞增殖的抑制力分別為9.88%、19.35%、26.20%，隨著時間的延長細胞的活力越來越低，細胞的抑制率越來越高。

表1 各組不同時間段A值

2.4白花蛇舌草對A549肺癌干細胞凋亡的影響 經(jīng)白花蛇舌草干預(yù)后細胞凋亡率為(27.903 30±0.405 26)%，對照組細胞凋亡率為(5.063 30±0.150 11)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.5白花蛇舌草對A549肺癌干細胞細胞分裂周期的影響 經(jīng)白花蛇舌草干預(yù)后處于G1期的細胞數(shù)明顯增多，S期的細胞數(shù)明顯減少，細胞分裂停滯于G1期，見表3。

表2 兩組細胞凋亡率比較

表3 兩組細胞周期分布

3 討 論

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類生命健康，其發(fā)病的分子機制尚未完全明確。肺癌干細胞是來源于肺癌組織中可被特異性標(biāo)志物標(biāo)記，具有多向分化、自我更新、無限增殖等生物學(xué)特征的異質(zhì)性細胞群，其與肺癌的侵襲、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、耐藥等惡性生物學(xué)特征密切相關(guān)[10]。腫瘤干細胞多呈靜息狀態(tài)，不僅能逃脫針對此細胞增殖的損傷，而且憑借其較強的修復(fù)能力，能對已造成的損傷進行最大程度的修復(fù)。肺癌干細胞表面轉(zhuǎn)運蛋白能將化療藥物轉(zhuǎn)運至胞外，降低細胞內(nèi)藥物濃度以減輕化療產(chǎn)生的影響[11-12]。隨著對肺癌研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明肺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及其對放、化療的耐受等生物學(xué)特性均與肺癌干細胞有關(guān)。中醫(yī)因思路獨道，治療方案個體化，化學(xué)結(jié)構(gòu)特殊而具有作用多靶點、療效確切及不良反應(yīng)輕等特點，近年來成為肺癌干細胞研究領(lǐng)域的新方向。

在古代中醫(yī)并沒有肺癌的病名，可歸入“肺積”“肺壅”“肺疽”“肺癰”“痞癖”“咳嗽”“咯血”等范疇。肺癌的病性屬于本虛標(biāo)實，基本病因病機屬于正虛邪毒，與痰濁聚肺、情志失調(diào)、煙毒內(nèi)蘊等有關(guān)。正氣虧虛，臟腑氣血陰陽失調(diào)，成為肺癌發(fā)病的基礎(chǔ)。一方面肺為嬌臟，邪氣從外而入，邪毒內(nèi)蘊，導(dǎo)致肺失宣降，肺氣閉郁，氣滯血瘀，日久積塊；另一方面津液輸布不利，積聚成痰，痰阻脈絡(luò)，血行不暢，痰瘀互結(jié)，從而形成腫塊[13]。有研究表明，在肺癌發(fā)生、發(fā)展的某些階段，熱毒是肺癌的主要致病因素之一，熱邪稽留，蒸灼津液，煉液為痰，痰阻經(jīng)絡(luò)，氣血運行不暢，熱、痰、瘀互結(jié)，形成熱毒，阻塞臟腑經(jīng)絡(luò)形成癌腫，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、疼痛、局部灼熱、腫塊增大等癥狀，治療應(yīng)以清熱解毒為主[14]。

白花蛇舌草屬于清熱解毒類中藥，微苦、甘、寒。歸胃、大腸、小腸經(jīng)，具有清熱解毒、利濕通淋等功效，臨床上多應(yīng)用于癰腫瘡毒、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、熱淋澀痛、濕熱黃疸等癥[15]。有研究表明[16]，其主要化學(xué)成分有蒽醌類、環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類、三萜類、甾醇類、香豆素類、烷烴等，能增強免疫活性、抗氧化和抗腫瘤活性。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)白花蛇舌草干預(yù)后的A549肺癌干細胞培養(yǎng)24、48、72 h后細胞的增殖力明顯受到抑制，細胞凋亡率增加，其細胞周期處于G1期的細胞數(shù)大幅度增加，處于S期的細胞數(shù)明顯減少，表明白花蛇舌草能促進細胞凋亡，阻滯肺癌干細胞的細胞周期。與普通體細胞相比，機體成體干細胞的細胞周期多處于G1期，當(dāng)機體組織受到損傷或刺激時，干細胞可由靜息期進入增殖、分化期，通過完成細胞的增殖和分化以修復(fù)機體。肝癌干細胞也具備這個特點，處于G1期的細胞具有較強的增殖和分化潛能。白花蛇舌草的干預(yù)明顯減少了A549肺癌干細胞G1期細胞的數(shù)量，從而抑制了惡性細胞的增殖和分化能力。

綜上所述，肺癌干細胞是腫瘤細胞增殖、分化及自我更新的母細胞，白花蛇舌草能有效地抑制肺癌干細胞的增殖，促進肺癌干細胞凋亡，阻滯肺癌干細胞的細胞周期，從而達到治療肺癌的目的，但其具體的作用機制還有待進一步研究。