徐 微張 鑫潘 磊陳培豐#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

2 河南省新密市中醫(yī)院 河南 新密 452370

3 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

蛇六谷，又名魔芋，性味辛寒，有小毒，具有化痰散結(jié)、行瘀消腫止痛等功效，作為抗癌中藥在浙滬地區(qū)廣泛使用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)蛇六谷中魔芋葡甘露聚糖(KGM)含量最多，約占50%～60%，是蛇六谷抗腫瘤作用的主要成分[1]。本實(shí)驗(yàn)在建立Lewis肺癌小鼠動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)KGM對(duì)荷瘤小鼠脾細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、核因子-κB抑制因子（IκB）表達(dá)的影響，為KGM的抗腫瘤作用提供一定的分子學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)近交C57BL/6純系小鼠50只，雄性，6～8周齡，體重16～20g；Lewis荷瘤小鼠4只，均購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物合格證號(hào):SCXK:（滬）2013-0016，飼養(yǎng)于我校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物:純化魔芋微粉，成都市圣特蒙魔芋微粉有限責(zé)任公司，批號(hào):140305，KGM含量為98%。環(huán)磷酰胺（CTX），0.2g/瓶，山西普德藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào):04141103。

1.3 試劑及儀器:RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶，美國(guó)Gibco公司；紅細(xì)胞裂解液，Beyotime公司；PBS（磷酸鹽緩沖液），吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，上海翊圣生物科技有限公司；小鼠NF-κB ELISA和IκB ELISA試劑盒，上海翔升生物科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及分組方法:在無(wú)菌條件下，頸椎脫臼法處死4只荷Lewis肺癌小鼠，取生長(zhǎng)良好的新鮮腫瘤組織，剔除包膜及壞死組織，剪碎，勻漿，過(guò)濾制成混懸液，離心后加生理鹽水，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×107/ml。在無(wú)菌條件下以0.2ml/只（含瘤細(xì)胞數(shù)2×106個(gè)）接種于50只C57BL/6小鼠右側(cè)腋窩皮下，30min內(nèi)完成。接種24h后，將50只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，分別為荷瘤空白對(duì)照組（NS組），陽(yáng)性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺組，CTX組），KGM低、中、高劑量組，每組10只并稱重。

2.2 給藥方法:參考林慧敏等[2]的給藥方法，將KGM溶于水，其中KGM低、中、高劑量組分別按100mg/(kg·d)、200mg/(kg·d)、300mg/(kg·d)連續(xù)灌胃13d，每日總量0.2ml；生理鹽水組以等劑量灌胃生理鹽水13d；環(huán)磷酰胺組給藥劑量參照人鼠給藥劑量換算，以30mg/kg腹腔注射給藥，2次/周，共計(jì)4次。

2.3 脾臟標(biāo)本采集:給藥后第14d頸椎脫臼處死小鼠，置于75%的酒精中浸泡5min，在超凈工作臺(tái)上，用無(wú)菌剪刀快速剪開(kāi)小鼠皮膚，以新的無(wú)菌剪刀剪開(kāi)腹膜，取出脾臟，放入液氮中冷凍備用。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)脾臟細(xì)胞中NF-κB和IκB-α的表達(dá):分述如下。

2.4.1 蛋白提取:采用液氮充分研磨脾組織，加入200μl蛋白提取緩沖液（50mM Tris HCl pH 7.6，1mM CaCl2，0.2%Triton X-100，0.5mM PMSF），充分振蕩混勻，室溫裂解10min。離心機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)整至12000rpm，離心10min，離心結(jié)束后將上清液轉(zhuǎn)至新的離心管中，放于-80℃冰箱備用。

2.4.2 蛋白濃度測(cè)定分析:①配置統(tǒng)一的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（規(guī)格見(jiàn)表1）:以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度為2mg/ml）制作蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別吸取BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液0μl、25μl、50μl、125μl、150μl、350μl、375μl、395μl 和400μl，各自加入0.01MPBS溶液補(bǔ)足到2000μl，配成梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分裝后-20℃保存，備用。②配制BCA工作液:計(jì)算所需要的總BCA工作液體積?？侭CA工作液體積=（BSA標(biāo)準(zhǔn)品+待測(cè)樣品）×重復(fù)數(shù)×每個(gè)樣品所需要的BCA工作液；將BCA試劑A和B按照50∶1的體積比混合均勻，注意二者混合后迅速渾濁，混勻后混合物迅速變澄清。將上述步驟所得混合工作液裝入密封容器內(nèi)，室溫條件24h穩(wěn)定。

表1 配置BSA標(biāo)準(zhǔn)品體系

2.4.3 微孔板檢測(cè)方法（樣品:BCA工作液=1∶8）:各取10標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品加入到微孔板中（即1∶20），試劑盒的檢測(cè)范圍為125～2000μg/ml。注意:待測(cè)樣品要先稀釋一定的倍數(shù)再進(jìn)行測(cè)量，稀釋的倍數(shù)需進(jìn)行摸索。在每孔中加入200μl BCA工作液，振蕩30s混合均勻。蓋上微孔板，37℃條件下孵育30min。室溫冷卻，在酶標(biāo)儀上的562nm波長(zhǎng)范圍處檢測(cè)吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白濃度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，最終結(jié)果以±s的形式表示，樣本符合正態(tài)分布且方差齊性時(shí)，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異。

3 結(jié)果

3.1 成功建立小鼠移植瘤模型:接種7d后可在各小鼠腋窩皮下觸及米粒大小的結(jié)節(jié)，質(zhì)硬，活動(dòng)度一般，邊界清楚，表面凹凸不平，連續(xù)觀察13d，期間小鼠腋下結(jié)節(jié)增大明顯，表示移植瘤接種成功，符合實(shí)驗(yàn)要求。

3.2 KGM對(duì)荷瘤小鼠脾細(xì)胞NF-κB、IκB表達(dá)的影響：見(jiàn)表2。

表2 KGM對(duì)荷瘤小鼠脾臟細(xì)胞NF-κB、IκB表達(dá)的影響（±s，pg/ml）

表2 KGM對(duì)荷瘤小鼠脾臟細(xì)胞NF-κB、IκB表達(dá)的影響（±s，pg/ml）

注:與NS組比較，☆P＜0.05，△P＜0.01；與CTX組比較，▲P＜0.01。

IκB表達(dá)量39.28±5.95▲64.04±6.55△45.78±2.98▲49.01±3.91☆▲66.96±5.69△組別NS組CTX組KGM低劑量組KGM中劑量組KGM高劑量組例數(shù)10 10 10 10 10 NF-κB表達(dá)量360.83±16.71▲245.35±24.35△334.79±15.59▲316.13±29.83☆▲246.41±10.76△

4 討論

我們前期研究發(fā)現(xiàn)KGM可有效抑制荷瘤小鼠瘤體的生長(zhǎng)，提高荷瘤小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)，而且荷瘤小鼠脾細(xì)胞中T細(xì)胞增殖分化也有顯著提高；還可能通過(guò)影響THP-1源巨噬細(xì)胞白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和γ干擾素（IFN-γ）mRNA及蛋白的表達(dá)來(lái)達(dá)到免疫調(diào)節(jié)的作用，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。故提高荷瘤小鼠的免疫功能可能是KGM抗腫瘤的機(jī)制之一。關(guān)于KGM的抗腫瘤機(jī)制應(yīng)該還有很多，本實(shí)驗(yàn)則嘗試從抑制腫瘤血管生成方面探討KGM的可能作用機(jī)制。

抑制腫瘤血管生成是防止腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移、改善患者預(yù)后和提高生存率的重要措施之一。目前研究已發(fā)現(xiàn)30余種促血管生成因子，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）是重要的因子之一。NF-κB是一類普遍存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，有抑制凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移等作用。VEGF的表達(dá)與NF-κB成正相關(guān)，在腫瘤的血管形成中NF-κB起著核心作用，可通過(guò)上調(diào)核心因子VEGF的表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤血管形成。而NF-κB的激活受其抑制因子——IκB(尤其是IκB-α)的調(diào)控。IκB可通過(guò)與NF-κB二聚體結(jié)合，形成NF-κB/IκB復(fù)合物。外源性刺激通過(guò)活化IκB激酶（IKK）使得IκB磷酸化，并進(jìn)一步降解，使NF-κB發(fā)生核異位，與靶基因的特異位點(diǎn)相結(jié)合，從而使NF-κB失去活性，抑制腫瘤生長(zhǎng)及減少新生血管生成。所以NF-κB、IκB二者在腫瘤的形成及發(fā)展過(guò)程中具有舉足輕重的作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)荷瘤小鼠脾細(xì)胞NF-κB及IκB的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，荷瘤空白對(duì)照組中NF-κB表達(dá)量最高，而IκB表達(dá)量最低，隨著KGM用藥濃度的增加，NF-κB的表達(dá)量逐漸降低，IκB的表達(dá)則逐漸上升，雖然三個(gè)KGM給藥組之間并無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但仍具有一定的量效關(guān)系。故我們認(rèn)為，KGM的抗腫瘤作用也可能是通過(guò)下調(diào)NF-κB并且上調(diào)IκB的表達(dá)，或者穩(wěn)定IκB的活性、抑制了VEGF的表達(dá)，從而抑制了腫瘤新生血管的生成，進(jìn)而抑制了腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移來(lái)實(shí)現(xiàn)的。所以，KGM的抗腫瘤機(jī)制仍需要進(jìn)一步的深入探討。