王夢(mèng)蛟 崔艾麗 金承龍 方宇輝 金哲虎

延邊大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，吉林 延吉 133000

惡性黑素瘤是一種發(fā)病率較低但惡性度高、侵襲性強(qiáng)、死亡率高的皮膚癌［1］，始源于黑素細(xì)胞的異常增殖［2］。芬維A銨［fenretinide，N-（4-hydroxyphenyl）retinamide，4-HPR］是新一代合成的全反式維A酸類衍生物，與傳統(tǒng)維A酸相比，4-HPR毒性小、不良反應(yīng)少且耐受率高，在多種腫瘤中發(fā)揮調(diào)節(jié)分化、抗侵襲、抑制生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡等作用［3］，據(jù)報(bào)道也可顯著抑制黑素瘤細(xì)胞的增殖［4］。但其疏水性極強(qiáng)，導(dǎo)致生物利用度。但其疏水性極強(qiáng)，導(dǎo)致生物利用度低，難以達(dá)到滿意的治療效果。脂質(zhì)體是一種無(wú)毒性及免疫原性的藥物載體，含有類細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，具有降低藥物毒性、減少不良反應(yīng)、提高藥物治療指數(shù)等優(yōu)點(diǎn)，并且可以使藥物在腫瘤內(nèi)蓄積達(dá)到被動(dòng)靶向作用。藥物的靶向遞送是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，靶向蛋白的應(yīng)用被大量研究并具有良好的效果。整合素是表達(dá)于細(xì)胞表面的具有信號(hào)傳遞作用的跨膜受體，其中整合素αvβ3在包括人惡性黑素瘤細(xì)胞的多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生中具有重要作用［5-7］，精氨酸（R）-甘氨酸（G）-天冬氨酸（D）（RGD）序列是廣泛認(rèn)可的靶向整合素αvβ3的多肽序列［8］。本研究中我們將4-HPR以脂質(zhì)體進(jìn)行包載以提高水溶性，并且采用RGD多肽對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行修飾，通過(guò)其與黑素瘤細(xì)胞表面整合素αvβ3的特異性結(jié)合以實(shí)現(xiàn)藥物向腫瘤細(xì)胞的靶向遞送，并檢測(cè)4-HPR對(duì)B16F10和A375細(xì)胞的增殖、遷移抑制及凋亡誘導(dǎo)作用，和cRGDfk修飾4-HPR脂質(zhì)體對(duì)該作用的影響。

材料與方法

一、材料

鼠源高轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤B16F10細(xì)胞和人黑素瘤A375細(xì)胞（來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心），以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

4-HPR、膽固醇、甲醇［高效液相色譜（HPLC）級(jí)］、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK8）均為美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-mPEG2000）為美國(guó)Laysan Bio公司產(chǎn)品，蛋黃卵磷脂為上海東尚生物科技有限公司產(chǎn)品，巰基丙酸-cRGDfk為上海強(qiáng)耀生物科技有限公司產(chǎn)品，胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為北京四正柏生物科技有限公司產(chǎn)品，Agilent 1260型HPLC儀來(lái)自美國(guó)Agilent公司，JY92-ⅡN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)來(lái)自寧波新芝生物科技股份有限公司，Malvern Nano ZS型激光粒度分析儀來(lái)自英國(guó)Malvern公司，Spectra Max190型酶標(biāo)儀來(lái)自美國(guó)MD公司，EPICS XL型流式細(xì)胞分析儀為美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.薄膜-水化法制備芬維A銨脂質(zhì)體（4-HPRL）及RGD多肽修飾的4-HPRL（RGD-4-HPRL）：將巰基丙酸-cRGDfk與二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000-馬來(lái)酰亞胺（DSPE-mPEG-mal）按摩爾比1∶1溶于去離子水，氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后以雙蒸水透析48 h，冷凍干燥后得到RGD-DSPE-mPEG，以三氯甲烷為溶劑，以核磁共振氫譜（1H NMR）600 MHz鑒定其結(jié)構(gòu)。稱取4-HPR 9 mg，膽固醇7.5 mg，含或不含RGDDSPE-mPEG的DSPE-mPEG 9 mg（RGD-4-HPRL中RGD-DSPE-mPEG占1/10），蛋黃卵磷脂84 mg，置于250 ml圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入3 ml三氯甲烷溶解，50℃旋蒸干燥30 min至形成均勻薄膜，加入5%葡萄糖溶液6 ml水化，探頭超聲（超聲參數(shù)：超聲2 s，停1 s，能量150 W，時(shí)間15 min）后用直徑0.22 μm水膜過(guò)濾3次除去游離藥物，即得4-HPRL或RGD-4-HPRL的溶液。使用馬爾文粒徑儀檢測(cè)粒徑和電位，HPLC檢測(cè)4-HPR濃度，并測(cè)定包封率和載藥量。

2.細(xì)胞活性檢測(cè)：

（1）脂質(zhì)體材料對(duì)細(xì)胞活性的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16F10和A375細(xì)胞，0.25%胰酶常規(guī)消化后500×g離心4 min，按5×103個(gè)/孔接種于96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分為對(duì)照組、調(diào)零組和5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組6孔，調(diào)零組不給予任何處理，對(duì)照組加入新鮮DMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入含不同濃度（同1、10、20、30、50、100 mg/L 4-HPR組）空白脂質(zhì)體的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，后以CCK8試劑進(jìn)行染色［4］。酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處吸光度（A）值并計(jì)算細(xì)胞活性：細(xì)胞活性（%）=［（A實(shí)驗(yàn)組-A調(diào)零組）/（A對(duì)照組-A調(diào)零組）］×100%。

（2）4-HPR、4-HPRL和RGD-4-HPRL對(duì)B16F10和A375細(xì)胞活性的影響：細(xì)胞培養(yǎng)及分組方法同上，實(shí)驗(yàn)組分別加入含有不同濃度（4-HPR濃度均分別為10、20、30和50 mg/L）4-HPR、4-HPRL和RGD-4-HPRL的DMEM培養(yǎng)液，每孔200 μl。24 h后染色并采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組A450值，按上述方法計(jì)算細(xì)胞活性。

3.膜聯(lián)蛋白V/碘化丙錠染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡：按1.5×105個(gè)/孔分別接種兩種細(xì)胞于6孔板內(nèi)，每孔加入1 ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，分成對(duì)照組、4-HPR組、4-HPR-L組和RGD-4-HPRL組，每組3孔，對(duì)照組加入2 ml新鮮培養(yǎng)液，給藥組分別加入含4-HPR、4-HPRL和RGD-4-HPRL的DMEM培養(yǎng)液2 ml，其中4-HPR濃度均為10（B16F10細(xì)胞）或20 mg/L（A375細(xì)胞），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞并染色，檢測(cè)每孔細(xì)胞凋亡比例并統(tǒng)計(jì)分析［4］。早期凋亡細(xì)胞可以結(jié)合膜聯(lián)蛋白V，細(xì)胞顯示在右下象限；晚期凋亡細(xì)胞膜通透性增加，碘化丙錠可以進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合，細(xì)胞顯示在右上象限?？偟蛲黾?xì)胞即早期凋亡與晚期凋亡細(xì)胞之和。

4.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：分別取B16F10細(xì)胞和A375細(xì)胞，以1.0×105個(gè)/孔的密度接種于12孔板，每孔加入1 ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后分成對(duì)照組、4-HPR組、4-HPR-L組和RGD-4-HPRL組，每組3孔，對(duì)照組加入2 ml新鮮培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別給予4-HPR濃度為10 mg/L（B16F10細(xì)胞）或20 mg/L（A375細(xì)胞）的4-HPR、4-HPRL和RGD-4-HPRL的DMEM培養(yǎng)液1 ml，分別于給藥后即刻、24 h和48 h倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并拍照。

5.B16F10細(xì)胞對(duì)香豆素6（C6）的攝取情況：以C6取代4-HPR制備C6L和RGD-C6L。取B16F10細(xì)胞以1.5×105/孔接種于6孔板，24 h后分為對(duì)照組、C6組、C6L組及RGD-C6L組，每組3個(gè)復(fù)孔，分別加入含有1 mg/L C6的上述制劑的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)5 min，冷PBS漂洗3次，胰酶消化，500×g離心收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS Statistics 22.0軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、RGD-DSPE-mPEG表征

1H NMR對(duì)DSPE-mPEG和RGD-DSPE-mPEG結(jié)構(gòu)的鑒定結(jié)果顯示，DSPE-mPEG在化學(xué)位移6.70×10-6處有馬來(lái)酰亞胺中的α，β-不飽和雙鍵氫的特征峰，RGD-DSPE-mPEG在6.70×10-6處α，β-不飽和雙鍵氫的特征峰消失，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9］。見圖1。

二、4-HPRL與RGD-4-HPRL表征

通過(guò)薄膜-水化法制備的4-HPRL溶液中4-HPR濃度可高于1 300 mg/L。4-HPRL粒徑為（85.31±1.36）nm，電位為（-23.13±0.57）mV；RGD-4-HPRL粒徑為（90.76±0.55）nm，電位為（-24.43±0.50）mV。脂質(zhì)體粒徑分布均一，與4-HPRL相比，RGD-4-HPRL粒徑稍有增大，電位稍有降低。4-HPRL包封率（95.51±1.22）%，載藥量（7.27±0.11）%；RGD-4-HPRL包封率（95.82±0.81）%，載藥量（7.14±0.13）%。4-HPRL與RGD-4-HPRL均具有較高的包封率和載藥量，二者之間無(wú)明顯差異。

三、細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果

當(dāng)空白脂質(zhì)體濃度分別為10、20、30、50、100 mg/L時(shí)，24 h后B16F10細(xì)胞活性分別為（101.8±1.8）%、（99.5±2.6）%、（97.6±1.4）%、（90.8±2.0）%、（83.7±0.9）%，A375細(xì)胞活性分別為（101.1±1.3）%、（96.7±1.4）%、（94.5±1.9）%、（88.7±0.9）%、（79.5±0.5）%。可見RGD-4-HPRL載藥材料即RGD-空白脂質(zhì)體濃度≤30 mg/L時(shí)在24 h內(nèi)對(duì)B16F10細(xì)胞活性抑制低于5%，對(duì)A375細(xì)胞活性抑制低于7%，表明脂質(zhì)體材料生物相容性良好，無(wú)明顯細(xì)胞毒性。

由表1可見，4-HPR作用24 h可明顯抑制B16F10和A375細(xì)胞活性，抑制率接近50%的4-HPR濃度分別10 mg/L和20 mg/L，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)分別采用以上濃度。4-HPR濃度相同時(shí)，RGD-4-HPRL組兩種細(xì)胞的增殖抑制率明顯高于4-HPR組（均P＜0.01）和4-HPRL組（P＜0.01或0.05），且4-HPRL組高于4-HPR組（均P＜0.01）。表1顯示細(xì)胞增殖抑制率一般隨藥物濃度增加而逐漸升高，但當(dāng)抑制率增加到70%以上時(shí)基本保持穩(wěn)定。

四、4-HPR誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡研究

見圖2、表2。4-HPR可明顯誘導(dǎo)B16F10和A375細(xì)胞發(fā)生凋亡，且以晚期凋亡為主。4組間B16F10細(xì)胞（F=2 826.830，P＜0.01）和A375細(xì)胞凋亡率（F=279.002，P＜0.01）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中，4-HPRL組兩種細(xì)胞凋亡率均高于4-HPR組（t值分別為25.338、6.870，均P＜0.01），RGD-4-HPRL組凋亡率又高于4-HPR組（t值分別為43.152、14.016，均P＜0.01）及4-HPRL組（t值分別為8.145、10.243，均P＜0.01）。

圖1 DSPE-mPEG-mal與RGD-DSPE-mPEG的1H NMR鑒定圖譜1A為DSPE-mPEG-mal核磁圖譜，可見6.70×10-6處馬來(lái)酰亞胺特征峰；1B為RGD-DSPE-mPEG核磁圖譜，6.70×10-6處馬來(lái)酰亞胺特征峰消失。DSPE-mPEG：二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇；DSPE-mPEG-mal：二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺

表1 4-HPR、4-HPRL和RGD-4-HPRL對(duì)B16F10細(xì)胞和A375細(xì)胞增殖的抑制率比較（±s）

表1 4-HPR、4-HPRL和RGD-4-HPRL對(duì)B16F10細(xì)胞和A375細(xì)胞增殖的抑制率比較（±s）

注：n=4。相同濃度條件下，a與4-HPR組同種細(xì)胞相比，P＜0.01；與4-HPRL組同種細(xì)胞相比，bP＜0.01，cP＜0.05。4-HPR：芬維A銨；4-HPRL：4-HPR脂質(zhì)體；RGD-4-HPRL：含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的環(huán)形多肽cRGDfk修飾的4-HPRL

4-HPR濃度（mg/L）10 20 30 50 F值P值B16F10（%）A375（%）4-HPR組38.5±2.7 47.3±3.9 50.6±3.2 62.4±0.9 35.254＜0.01 4-HPRL組55.7±0.5a 68.1±1.8a 73.0±1.4a 74.8±0.7a 155.653＜0.01 RGD-4-HPRL組69.3±1.9a b 73.7±1.2a b 75.1±2.2a 73.5±1.4a 6.495＜0.05 4-HPR組19.6±0.2 27.0±2.4 39.7±0.7 49.9±1.7 180.082＜0.01 4-HPRL組36.8±0.8a 44.9±1.5a 51.0±2.3a 58.7±2.0a 84.322＜0.01 RGD-4-HPRL組38.9±0.8a c 54.9±1.5a b 61.7±0.1a b 65.9±0.4a b 552.903＜0.01

圖2 4-HPR作用24 h對(duì)B16F10細(xì)胞和A375細(xì)胞凋亡的影響4-HPR：芬維A銨；4-HPRL：4-HPR脂質(zhì)體；RGD-4-HPRL：含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的環(huán)形多肽cRGDfk修飾的4-HPRL

表2 4-HPR、4-HPRL和RGD-4-HPRL對(duì)B16F10細(xì)胞和A375細(xì)胞凋亡率的影響（±s，%）

表2 4-HPR、4-HPRL和RGD-4-HPRL對(duì)B16F10細(xì)胞和A375細(xì)胞凋亡率的影響（±s，%）

注：n=3。a與對(duì)照組相比，P＜0.01；b與4-HPR組相比，P＜0.01；c與4-HPRL組相比，P＜0.01。4-HPR：芬維A銨；4-HPRL：4-HPR脂質(zhì)體；RGD-4-HPRL：含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的環(huán)形多肽cRGDfk修飾的4-HPRL

分組對(duì)照組4-HPR組4-HPRL組RGD-4-HPRL組B16F10細(xì)胞4.44±0.35 28.33±0.66a 46.43±0.77a b 51.33±0.37a b c A375細(xì)胞4.97±0.62 16.68±3.81a 32.62±1.24a b 44.85±4.92a b c

五、4-HPR抑制細(xì)胞遷移

見圖3。給藥后24 h，對(duì)照組已有愈合傾向，而實(shí)驗(yàn)組愈合不明顯；48 h后對(duì)照組劃痕基本愈合，4-HPR組劃痕變窄但仍清晰可見，而4-HPRL組和RGD-4-HPRL組劃痕愈合明顯減慢。

六、B16F10細(xì)胞對(duì)C6的攝取情況

孵育5 min后，細(xì)胞內(nèi)C6的熒光強(qiáng)度在對(duì)照組為2.15±0.28，C6組為8.56±0.36，C6L組為20.48±0.13，RGD-C6L組為22.55±0.07，各組間平均熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=67 194.186，P＜0.01）。與C6組相比，C6L組與RGD-C6L組攝取量明顯增加（t值分別為44.097和54.065，P＜0.01），且RGD-C6L組又多于C6L組（t值為19.611，P＜0.01）。

討論

4-HPR作為新一代全反式維A酸衍生物，可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖［4，10］，具有毒性小、不良反應(yīng)發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)。本研究中，我們通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)證實(shí)4-HPR可抑制B16F10和A375細(xì)胞增殖、遷移并誘導(dǎo)凋亡。但是，4-HPR水溶性極低，在使用時(shí)通常以聚氧乙烯蓖麻油和乙醇作為溶劑，但聚氧乙烯蓖麻油可引起人體組胺釋放從而導(dǎo)致嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。脂質(zhì)體作為新型藥物載體，無(wú)毒性及免疫原性、適合體內(nèi)降解，具有降低藥物毒性、減少不良反應(yīng)、提高藥物治療指數(shù)、減少藥物劑量等優(yōu)點(diǎn)，并且能夠通過(guò)EPR效應(yīng)使藥物在腫瘤內(nèi)蓄積。在本實(shí)驗(yàn)中采用薄膜-水化法制備的脂質(zhì)體制劑對(duì)4-HPR進(jìn)行包載，明顯提高了4-HPR的水溶性，且粒徑大小均一，并且具有較高的包封率和載藥量。

整合素αvβ3是細(xì)胞黏附受體整合蛋白家族成員，不僅參與細(xì)胞黏附，還參與細(xì)胞跨膜信號(hào)的雙向傳導(dǎo)［11］，在多種腫瘤細(xì)胞包括黑素瘤和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高表達(dá)［12-13］，而在正常細(xì)胞表達(dá)極低或不表達(dá)，且促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移和血管生成。因此，整合素αvβ3成為腫瘤治療的重要靶標(biāo)，RGD是整合素αvβ3的特異性配體，Kang等［14］發(fā)現(xiàn)RGD修飾的蛇毒提取物可通過(guò)阻斷整合素αvβ3抑制黑素瘤B16F10細(xì)胞的黏附和遷移。本實(shí)驗(yàn)中我們以cRGDfk作為靶蛋白對(duì)4-HPRL進(jìn)行修飾，通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞表面的整合素αvβ3特異性結(jié)合使藥物高度識(shí)別并進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，證實(shí)通過(guò)脂質(zhì)體或RGD靶向蛋白修飾的脂質(zhì)體對(duì)4-HPR進(jìn)行包裹可顯著提高4-HPR對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響。C6攝取實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體明顯增加細(xì)胞對(duì)藥物的攝取速度，而對(duì)脂質(zhì)體采用cRGDfk修飾后，細(xì)胞對(duì)藥物的攝取進(jìn)一步增多，且大量研究表明直徑在100 nm左右的脂質(zhì)體可以通過(guò)實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)在腫瘤內(nèi)蓄積，使其更好更快地發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用。通過(guò)細(xì)胞對(duì)RGD-C6L的攝取和反應(yīng)可以看出通過(guò)RGD序列向黑素瘤細(xì)胞主動(dòng)遞送藥物是有效的。

圖3 芬維A銨（4-HPR）對(duì)B16F10和A375細(xì)胞劃痕愈合的影響4A：B6F10細(xì)胞；4B：A375細(xì)胞。4-HPRL：4-HPR脂質(zhì)體；RGD-4-HPRL：含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的環(huán)形多肽cRGDfk修飾的4-HPRL

將藥物靶向遞送到腫瘤細(xì)胞一直是我們致力研究的重點(diǎn)，對(duì)B16F10和A375細(xì)胞的體外研究顯示，4-HPR具有明顯抑制黑素瘤細(xì)胞增殖、遷移并誘導(dǎo)凋亡的作用，有望成為治療黑素瘤的新型藥物，而脂質(zhì)體及RGD靶向脂質(zhì)體可顯著提高4-HPR的作用，但RGD修飾的4-HPRL對(duì)黑素瘤的體內(nèi)治療效果及優(yōu)勢(shì)有待進(jìn)一步研究。