鐘榮玉，段新旺*，牛海濤

(1. 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，南昌 330006； 2. 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，國(guó)家中醫(yī)藥管理局，北京 100021)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE，以下簡(jiǎn)稱狼瘡)是一種累及全身多臟器的自身免疫性結(jié)締組織病，發(fā)病機(jī)制尚不明確，環(huán)境因素的暴露[1]、激素水平紊亂[2]和感染等都是潛在的致病因素。狼瘡患者常出現(xiàn)抗核抗體水平的升高，抗核抗體包括抗sm抗體、抗SS-A抗體和抗Scl-70抗體等，各抗體在不同自身免疫系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著不同的作用[3]。而抗dsDNA抗體是狼瘡疾病活動(dòng)性的指標(biāo)[4]，與狼瘡腎炎有著密切關(guān)系，是臨床診斷及治療效果觀察的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

皮膚病變?cè)诶钳徎颊咧校抢^腎受累外，較為多見(jiàn)的病變部位[5]。年輕女性狼瘡患者常見(jiàn)皮膚癥狀，表現(xiàn)為特異性皮損如蝶形紅斑[6]、盤(pán)狀紅斑，非特異皮損光敏感、口腔潰瘍、脫發(fā)、皮膚血管炎等。關(guān)于狼瘡皮膚病變的原因，有研究認(rèn)為可能和紫外線暴露[7]、淋巴細(xì)胞、炎癥因子、免疫復(fù)合物等因素有關(guān)[8]，但具體機(jī)制未清，其主要原因在于目前尚未有很好的皮膚型狼瘡動(dòng)物模型加以研究。

TC小鼠是由C57BL/6 小鼠與狼瘡NZM2410 小鼠多代雜交后建立的、同時(shí)攜帶三種狼瘡易感基因簇(Sle1/Sle2/Sle3) 的純合遺傳性自發(fā)狼瘡小鼠，即B6.NZMSle1/2/3小鼠(簡(jiǎn)稱TC小鼠)，是一種以C57BL/6為背景的遺傳性狼瘡小鼠。該小鼠能夠充分模擬人類系統(tǒng)性紅斑狼瘡的疾病表征，表現(xiàn)出升高的抗dsDNA抗體、抗ANA抗體和狼瘡腎炎等典型狼瘡癥狀[9]。本研究通過(guò)長(zhǎng)期觀察，發(fā)現(xiàn)該小鼠從40周齡開(kāi)始出現(xiàn)皮膚病變，血清抗體檢測(cè)及皮膚組化結(jié)果顯示，該小鼠可作為研究慢性皮膚型狼瘡發(fā)病機(jī)理的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

TC小鼠為美國(guó)佛羅里達(dá)大學(xué)Morel Laurence教授所贈(zèng)送。C57BL/6 小鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司【SCXK(京)2014-0004】，飼養(yǎng)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所SPF動(dòng)物房，所有實(shí)驗(yàn)操作在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所完成【SYXK(京)2015-0035】，實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所倫理委員會(huì)審批(NHT17002)。

1.1.2 試劑和材料

小鼠抗ANA抗體ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自ADI公司；標(biāo)記抗體Goat Anti-Mouse IgG購(gòu)自Southern Biotech公司；酶底物顯色劑phosphatase substrate、包被抗原dsDNA及O.C.T冰凍組織包埋膠購(gòu)自Sigma公司；17β雌二醇緩釋片(1.5 mg/60 d)購(gòu)自美國(guó)IRA公司；蘇木素、伊紅染色液購(gòu)自北京盈利精細(xì)化工有限公司；乙醇、二甲苯溶液購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 觀察和對(duì)比小鼠皮膚病變情況

觀察老齡TC小鼠皮膚受損狀況。將17β雌二醇緩釋片植入8周的雌性TC小鼠皮下，觀察記錄出現(xiàn)皮膚癥狀的時(shí)間。將有皮膚癥狀的小鼠進(jìn)行固定，分別暴露頸部、背部、耳廓部位皮膚，用軟尺測(cè)量并計(jì)算皮損部位面積，用相機(jī)拍照。

1.2.2 血清抗ANA抗體及抗dsDNA抗體檢測(cè)

采用臉頰采血法，收集40周齡以上雌性TC鼠與同齡C57BL/6小鼠的血液50 μL，室溫靜置1 h，9000 r/min 離心10 min，取上清。ELISA法檢測(cè)血清相應(yīng)抗體。

1.2.3 皮膚HE染色

取老齡TC小鼠病變部位皮膚，用O.C.T膠進(jìn)行包埋，放置于-20℃冰箱保存。取6 μm冰凍切片進(jìn)行HE染色，具體步驟：無(wú)水乙醇固定后蘇木精液染色 2 min，流水洗凈，鹽酸乙醇(100 mL 70%乙醇 + 0.5 mL濃鹽酸)脫去多余染色劑，再進(jìn)行伊紅染色，并經(jīng)過(guò)80%乙醇、95%乙醇和100%無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明化切片，最后中性樹(shù)膠封片。

1.3 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 TC小鼠出現(xiàn)皮膚病變癥狀

經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，TC小鼠皮膚受累癥狀表現(xiàn)為被覆毛發(fā)脫失，主要見(jiàn)于背部(圖1A)；頸部皮膚潰瘍(圖1B)；耳廓部皮膚潰爛(圖1C)。而同齡C57BL/6小鼠則無(wú)皮膚病變表現(xiàn)(圖1D)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，66.6%的老齡TC小鼠會(huì)出現(xiàn)不同程度的皮膚受累癥狀,而同齡的C57BL/6小鼠則無(wú)皮膚病變(圖1E)。TC小鼠出現(xiàn)典型的皮膚受損癥狀，與部分狼瘡患者出現(xiàn)皮膚受累癥狀相符合。(如圖1)

注：A.TC小鼠背部脫毛；B.TC小鼠頸部；C.TC小鼠耳廓部；D.同齡C57BL/6小鼠皮膚；E TC小鼠和C57BL/6小鼠數(shù)量及出現(xiàn)皮膚病變小鼠所占比例，陰影部位表示皮膚病變TC小鼠數(shù)目(n=30)。圖1 同齡 TC和C57BL/6小鼠皮膚病變癥狀及出現(xiàn)皮膚受累的小鼠所占比例Note．A. TC mouse back hair loss. B. TC mouse neck. C. TC mouse auricle. D. Skin of the same age C57BL/6 mice. E. Number of TC mice and C57BL/6 mice and the percentage of mice with skin lesions. (n=30)Figure 1 Proportion of skin lesions and skin involvement in the same age TC and C57BL/6 mice

2.2 年齡在TC小鼠皮膚病變中發(fā)揮重要作用

TC小鼠的皮膚病變癥狀隨著周齡的增大而逐漸加重。在38周前未發(fā)現(xiàn)皮膚受損情況，40周開(kāi)始出現(xiàn)被覆毛發(fā)脫失，并且隨著周齡增大，更多小鼠出現(xiàn)皮膚受累癥狀，已出現(xiàn)皮膚受損的小鼠則癥狀逐漸加重，表現(xiàn)為彌漫性脫毛，甚至發(fā)展為潰爛，白色粘液樣物質(zhì)滲出，癥狀嚴(yán)重者可累及眼球。隨時(shí)間變化TC小鼠皮膚受累癥狀如圖所示(圖2)。結(jié)果顯示，隨著年齡的增長(zhǎng)，皮膚受累的TC小鼠數(shù)量逐漸增加，皮損面積逐漸增大，癥狀逐漸加重，表明大部分TC小鼠在老齡出現(xiàn)皮膚癥狀，而同齡C57BL/6小鼠則無(wú)皮膚癥狀。

2.3 皮膚病變的老齡TC小鼠均表現(xiàn)為血清抗ANA抗體及抗dsDNA抗體陽(yáng)性

兩組小鼠血清抗dsDNA抗體檢測(cè)結(jié)果如圖3所示：TC小鼠血清抗dsDNA抗體OD值明顯升高，C57BL/6小鼠抗dsDNA抗體(anti-double-stranded (ds) DNA antibodies)則全部為陰性(圖3 A)。老齡TC小鼠血清抗ANA抗體(anti-nuclear antibodies)明顯升高于同齡C57BL/6小鼠(圖3B)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。TC小鼠的血清抗dsDNA和抗ANA抗體較C57BL/6小鼠明顯升高且具有顯著差異，說(shuō)明TC小鼠是典型的狼瘡疾病小鼠。

2.4 TC小鼠的皮膚病變部位有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)

小鼠皮炎部位皮膚冰凍切片HE染色結(jié)果顯示：TC鼠皮膚角質(zhì)層缺失，上皮層連續(xù)性中斷(圖4 A)，真皮層大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，毛囊減少乃至消失(圖4B)。而C57BL/6小鼠角質(zhì)層及上皮層細(xì)胞完整(圖4C)。為了探究老齡TC小鼠的皮膚癥狀屬于急性還是慢病變，我們用17β雌二醇緩釋片處理8周的雌性TC小鼠，4周后即可出現(xiàn)皮膚癥狀，其皮膚染色結(jié)果顯示上皮層完全缺失，但未見(jiàn)明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4D)。老齡TC小鼠皮膚真皮層有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，而17β雌二醇處理的TC小鼠皮膚真皮層淋巴細(xì)胞明顯減少，兩種皮膚病變呈現(xiàn)明顯差異，且都與同齡C57BL/6小鼠有明顯不同(如圖4)，表明老齡TC小鼠的皮膚病變較符合慢性皮膚病變。老齡TC小鼠血清自身抗體水平升高，皮膚大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明皮膚病變和自身免疫存在緊密聯(lián)系。

注：A.皮膚病變的TC小鼠數(shù)目隨著周齡增加而增多(n=20)；B. TC小鼠皮膚受損面積隨著周齡增加而增大(n=20)。圖2 皮膚病變的TC小鼠數(shù)目增多及皮膚損傷面積逐漸增大Note. A. Number of the TC mice with skin lesions was increased with increasing age (n=20). B. Area of skin lesions in the TC mice was increased with increasing age (n=20).Figure 2 Increased number of TC mice with skin lesions and increased skin lesion area

注：a.C57BL/6小鼠與TC 小鼠的抗dsDNA OD值對(duì)比 (n=20)，***P < 0.05。b. C57BL/6小鼠與TC小鼠的抗ANA OD值對(duì)比(n=20)，*P < 0.05。圖3 TC小鼠與C57BL/6小鼠抗dsDNA 與抗ANA 抗體濃度Note. A. Comparison of the OD values of anti-ANA antibodies between C57BL/6 and TC mice (n=20).***P< 0.05. B. Comparison of the OD values of anti-dsDNA antibodies between C57BL/6 and TC mice (n=20).*P< 0.05.Figure 3 Concentrations of Anti-dsDNA and anti-ANA antibodies of the C57BL/6 and TC mice

注：A. TC小鼠上皮層中斷；B. TC小鼠真皮層大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，毛囊減少乃至消失；C. C57BL/6小鼠皮膚；D. 17β雌二醇處理的年輕雌性TC小鼠皮膚上皮層缺失。圖4 TC小鼠與C57BL/6小鼠皮膚的病理改變Note. A. Disruption of the epithelium in a TC mouse. B. Extensive lymphocyte infiltration in the dermis of a TC mouse. C. The skin tissue of a C57BL/6 mouse. D. Loss of skin epithelial layer in a 17β-estradiol-treated TC mouse.Figure 4 Pathological changes of the skin in TC and C57BL/6 mice

3 討論

3.1 TC小鼠是一種典型的用于研究狼瘡發(fā)病機(jī)制的小鼠模型

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種免疫紊亂的疾病，主要特點(diǎn)是自身抗體水平的升高。其常見(jiàn)的抗體為抗核抗體[10]，同時(shí)抗dsDNA抗體是狼瘡的特異性和疾病嚴(yán)重程度標(biāo)志[11]，在狼瘡的診斷和治療中發(fā)揮重要作用。在TC小鼠的研究報(bào)道中指出，在樹(shù)突狀細(xì)胞作用下[12]，B細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥因子IL-6 和 IFN-γ表達(dá)升高，影響了B細(xì)胞活化，過(guò)度活化的B細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞相互作用，分化為漿細(xì)胞并分泌自身抗體繼而引起各系統(tǒng)和臟器的損傷[13]。所以，TC小鼠作為一種遺傳狼瘡動(dòng)物模型，能較好的模擬狼瘡的發(fā)病癥狀并用作皮膚型狼瘡發(fā)病機(jī)制的探討。

3.2 狼瘡皮膚病變與自身免疫密切相關(guān)

關(guān)于皮膚型狼瘡發(fā)病機(jī)制的研究有很多。有文獻(xiàn)指出，角質(zhì)層釋放促炎因子，作用于上皮細(xì)胞基底層，發(fā)生抗原抗體反應(yīng)并促使角質(zhì)細(xì)胞的凋亡，并釋放免疫刺激的內(nèi)源性核酸，通過(guò)相關(guān)炎癥因子激活體內(nèi)先天性免疫應(yīng)答[14]，進(jìn)而介導(dǎo)狼瘡皮膚病變的形成。將狼瘡患者血清中的抗dsDNA IgG抗體提取出后注射到C57BL/6小鼠皮下，引起了皮膚的炎癥反應(yīng)，證實(shí)狼瘡血清抗dsDNA IgG與皮膚狼瘡有著緊密關(guān)系[15]。IL-1也可能是狼瘡皮膚病變的重要促炎因子[16]。免疫復(fù)合物沉積在皮膚也是導(dǎo)致狼瘡皮膚受損的原因[17]。TH17參與了狼瘡皮膚病變[18]。雖然自身抗體在狼瘡中扮演著重要作用，但其在皮膚型狼瘡發(fā)病機(jī)制中的作用目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)用狼瘡小鼠皮膚病變部位進(jìn)行病理檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)角質(zhì)層的缺失及大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步證實(shí)狼瘡皮膚病變與自身免疫密切相關(guān)。

3.3 老齡TC小鼠是良好的慢性皮膚型狼瘡的疾病模型

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者常有皮膚的受累，表現(xiàn)為顴骨兩側(cè)蝶形紅斑、盤(pán)狀紅斑，并伴有脫發(fā)和光敏感，但發(fā)病原因未明，其主要原因在于目前尚未良好的模型來(lái)研究皮膚型紅斑狼瘡。皮膚型紅斑狼瘡根據(jù)臨床表現(xiàn)及病程分為急性、亞急性和慢性皮膚型紅斑狼瘡。急性皮膚型紅斑狼瘡可能僅在多臟器受累前幾周或者數(shù)月發(fā)生，常為短暫的和非瘢痕性的皮疹[19]。用17β雌二醇處理年輕雌性TC小鼠4周后即可誘導(dǎo)急性皮膚癥狀的發(fā)生，此時(shí)檢測(cè)的TC小鼠血清抗dsDNA及抗ANA抗體均為陰性，符合急性皮膚型狼瘡的臨床表現(xiàn)。其皮膚病理結(jié)果顯示上皮層缺失，但淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

慢性皮膚型紅斑狼瘡好發(fā)于40 ～ 50歲的中老年女性，進(jìn)展到最后出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)性瘢痕脫發(fā)。本研究通過(guò)長(zhǎng)期觀察對(duì)比和記錄TC鼠皮膚受損情況，我們發(fā)現(xiàn)40周齡的TC小鼠中有66.6%出現(xiàn)典型的不可逆性皮膚受累癥狀，表現(xiàn)為頸部、背部、耳廓部的皮膚毛發(fā)脫失甚至潰爛，且隨著周齡的增加病變區(qū)域逐漸增大，HE染色顯示毛囊的減少甚至消失，這在既往相關(guān)研究中未曾報(bào)道過(guò)，而檢測(cè)老齡TC小鼠血清抗dsDNA及抗ANA抗體為陽(yáng)性，說(shuō)明老齡TC小鼠是典型的系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠，因此符合慢性皮膚型紅斑狼瘡的臨床表現(xiàn)。此外，相關(guān)文獻(xiàn)指出，TC小鼠20周齡即可產(chǎn)生高濃度的抗dsDNA抗體[20]，7個(gè)月左右可進(jìn)展為嚴(yán)重的狼瘡性腎炎[21]，但未有更大周齡的TC小鼠報(bào)道。我們推測(cè)，28周齡左右的TC小鼠由于表現(xiàn)出嚴(yán)重的狼瘡性腎炎癥狀，可以滿足對(duì)狼瘡自身抗體、狼瘡腎炎及淋巴細(xì)胞之間相互關(guān)系研究的需求，故多數(shù)研究無(wú)必要持續(xù)觀察至40周，所以未發(fā)現(xiàn)TC小鼠有皮膚受累癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)老齡的TC小鼠有脫毛和皮膚潰爛的癥狀，檢測(cè)其體內(nèi)抗dsDNA抗體和抗ANA抗體升高，證實(shí)該鼠為典型的狼瘡疾病小鼠，通過(guò)皮膚病理檢查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)潰爛皮膚部位真皮層大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，表明皮膚病變的TC小鼠與自身免疫有著密切關(guān)系。綜上，老齡TC小鼠作為典型的狼瘡疾病小鼠，可作為一種新的慢性皮膚型紅斑狼瘡小鼠模型。