楊慧，陳德經(jīng)，2，*，陳海濤，董夢堯

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723001；2.陜西理工大學(xué)陜西省資源生物重點實驗室，陜西漢中723001；3.漢中龍鯢生物工程股份有限公司，陜西漢中723001）

大鯢（Andrias davidianus）俗稱“娃娃魚”，屬有尾目、隱鰓鯢科，是魚類和爬行動物之間的代表兩棲類過渡類型，有“生物界活化石”的美稱[1]，大鯢是傳統(tǒng)名貴藥用動物之一，其肌肉、內(nèi)臟、骨骼、表皮及皮膚分泌物均可入藥，目前大鯢體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)50 多種天然活性物[2]。近年來，人們對大鯢的研究主要集中在大鯢肉和大鯢皮膚黏液等方面，有關(guān)大鯢皮膚黑色素的研究極少。

黑色素是酚類或吲哚類物質(zhì)通過氧化聚合形成的高分子生物色素，與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密，其不溶于水、酸和常見的有機(jī)溶劑，可溶于氫氧化鈉，三乙胺等堿性溶液[3]。自然界的黑色素有兩類，一類是真黑色素，含氮不含硫，呈棕色或黑色；另一類是脫黑色素，既含氮又含硫，通常呈黃色或微紅棕色[4]。動物黑色素食品行業(yè)有著廣泛的用途，可添加到抗菌劑、防曬劑和黑發(fā)素等產(chǎn)品中。在動物天然色素的開發(fā)利用上，主要集中在烏雞、烏賊、黑螞蟻[10-12]等動物，兩棲類動物黑色素的研究鮮見報道。

本試驗用堿溶酸沉法對大鯢皮膚黑色素提取純化，采集其紫外-可見、紅外譜圖，以此對大鯢皮黑色素進(jìn)行定性分析。同時，測定大鯢皮膚黑色素的穩(wěn)定性、抗氧化、抗紫外及抗菌活性，以期為大鯢皮膚黑色素的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大鯢皮：漢中龍鯢生物工程股份有限公司。

烏賊黑色素（CAS：8049-97-6）：美國sigma 公司；溴化鉀（色譜純）：天津天光光學(xué)儀器有限公司；抗壞血酸：天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心；硫酸亞鐵、水楊酸：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷：上海源葉生物科技有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉、石油醚、過氧化氫、甲醇、95%乙醇、鹽酸、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、氨水、三乙胺、CuSO4、MgCl2、CaCl2、Na2SO4、FeCl3、ZnCl2（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；檸檬酸：天津市百世化工有限公司；木瓜蛋白酶（酶活為1 000 U/mg）：北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：陜西理工大學(xué)資源生物實驗室菌種保藏中心；土霉素片：云南白藥集團(tuán)股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BRUKER VERTEX 70 紅外光譜儀：德國布魯克有限公司；UV-1750 型紫外可見分光光度儀：日本島津儀器公司；LC-800 低速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司；BGZ-76 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司；JA5003 電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DZF-6050 型真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；601 超級水浴鍋：金壇市瑞華儀有限公司；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SX-700 高壓蒸汽滅菌鍋：TOMY SEIK 公司；HMS-350 小型旋渦振蕩器：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大鯢皮脫色、色素提取及純化工藝

大鯢皮→浸鹽水（6 %NaCl，60 min）→檸檬酸脫色（0.1 %，45 ℃水浴90 min）→色素去除→色素稱量→酶解蛋白質(zhì)（5 %木瓜蛋白酶，55 ℃水浴4 h）→離心（4 000 r/min，5 min）→脂肪溶解（石油醚溶解2次）→抽濾→堿溶（6 %NaOH）→離心（4 000 r/min，10 min）→取上清液→酸沉（HCI 調(diào)pH 值至1.0）→沉淀物→重復(fù)堿溶酸沉操作2 次～3 次→收集沉淀物→水洗沉淀物→真空干燥→大鯢皮黑色素。

1.2.2 大鯢皮色素溶解度的測定

分別稱取1 mg 大鯢皮黑色素于具塞試管中，在28 ℃條件下加入10 mL 不同種類的酸、堿、有機(jī)溶劑，在振蕩器上充分混勻，觀察其溶解性，再將試管置于超聲清洗器中超聲30 min，觀察其溶解性有無變化。

1.2.3 大鯢皮色素定性分析

1.2.3.1 大鯢皮色素的紫外-可見光光譜

取大鯢皮色素若干，在常溫下溶于4%的氫氧化鈉溶液中，制得大鯢皮色素堿溶液，以UV-VIS 型紫外分光光度計測定200 nm～800 nm 色素溶液的吸光值，繪制吸光值隨波長變化的曲線圖。

1.2.3.2 紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片法：將溴化鉀結(jié)晶塊在瑪瑙缽體中研成細(xì)粉，準(zhǔn)確稱取150 mg 溴化鉀粉末兩份，一份加入純化后色素樣品1 mg 研細(xì)混勻，另一份作為空白用以扣除本底，分別進(jìn)行壓片。在傅立葉變換紅外光譜儀上4 000 cm-1～400 cm-1區(qū)間測定紅外光譜。

1.2.4 大鯢皮色素的穩(wěn)定性分析

1.2.4.1 大鯢皮色素的熱穩(wěn)定性

取大鯢皮色素溶液于具塞試管中，分別放在28、40、60、80、100 ℃恒溫水浴鍋中，然后依次測定0、2、4、6、8 h 黑色素溶液在360 nm 處的吸收值。

1.2.4.2 大鯢皮色素的光穩(wěn)定性

取大鯢皮色素溶液于具塞試管中，在自然光和陰暗處分別放置7、14、21 d，觀察溶液的顏色變化，并在360 nm 處檢測其吸光值。

1.2.4.3 對金屬離子的穩(wěn)定性分析

取大鯢皮色素色素溶液5 mL，分別用配置好的0.5 g/L 的CuSO4、MgCl2、CaCl2、FeCl3和ZnCl2定容至25 mL，依次測定10 min、12、24、48 h 大鯢皮色素溶液在360 nm 處的吸光值。

1.2.5 大鯢皮色素抗氧化活性檢測

1.2.5.1 清除超氧陰離子自由基（O2-·）的檢測方法

取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液1 mL，加入0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH=8.2）4.5 mL，在25 ℃水浴10 min后，加入3 mmol/L 鄰苯三酚溶液0.2 mL 混勻，在25 ℃水浴5 min，最后加入8 mmol/L HCl 終止反應(yīng)，在波長299 nm 處測定其吸光度值，以4%NaOH 溶液調(diào)零，抗環(huán)血酸為陽性對照，平行測定吸光度值3 次。按式1 計算超氧陰離子自由基清除率：

式中：A0為不加樣品溶液，加入鄰苯三酚的溶液吸光度；A1為加入樣品溶液和鄰苯三酚的溶液吸光度；A2為加入樣品溶液但不加鄰苯三酚的溶液吸光度。

1.2.5.2 清除羥基自由基（·OH）的檢測方法

向試管中加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2 mL，9 mmol/L 硫酸亞鐵2 mL、9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液2 mL，最后加入9 mmol/L 雙氧水2 mL 啟動反應(yīng)，振蕩混勻，37 ℃水浴保溫30 min，冷卻至21 ℃后離心（5 000 r/min，10 min），取上清液在波長510 nm 處每隔30 s 測定其吸光度值，以4%NaOH 溶液調(diào)零，抗環(huán)血酸為陽性對照，平行測定吸光度值3 次。按式2 計算羥自由基的清除率：

式中：A0為不加樣品溶液，加入水楊酸-乙醇顯色劑的溶液吸光度；A1為加入樣品溶液和水楊酸-乙醇顯色劑的溶液吸光度；A2為加入樣品溶液但不加水楊酸-乙醇顯色劑的溶液吸光度。

1.2.6 大鯢皮色素抗紫外性

用紫外-可見分光光度計分別掃描二氧化鈦（陽性對照）、大鯢皮色素溶液、烏賊色素溶液和超純水（陰性對照）在200 nm～280 nm、280 nm～320 nm、320 nm～400 nm3 個波長范圍的吸光值，然后生成曲線。200 nm～280 nm 為紫外短波區(qū)域（ultraviolet radiation c，UVC），280 nm～320 nm 為紫外中波區(qū)域（ultraviolet radiation b，UVB），320 nm～400 nm 為紫外長波區(qū)域（ultraviolet radiation a，UVA），吸光值越大，透射率越低，則阻光性越好，抗紫外能力也越強(qiáng)[13]。

1.2.7 大鯢皮色素的抗菌性

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g～20.0 g，水1 000 mL，pH 7.4～7.6，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

參考陳德經(jīng)等[14]的濾紙片法并稍作修改。先將大鯢皮黑色素和土霉素分別用無菌的0.01%氫氧化鈉配制成濃度為1.5 mg/mL 的溶液，然后活化供試菌種，配置菌懸液。在超凈工作臺中將滅菌后的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，用移液槍吸取200 μL 稀釋10 倍的菌懸液對號放入平皿中，涂布棒涂布均勻。A 培養(yǎng)皿接種大腸桿菌，B 培養(yǎng)皿接種銅綠假單胞菌，C 培養(yǎng)皿接種藤黃微球菌，D 培養(yǎng)皿接種金黃色葡萄球菌。

將6 mm 的圓形滅菌濾紙片分別在大鯢皮色素溶液、土霉素溶液、水及0.01%氫氧化鈉中浸泡30 min，而后用無菌鑷子將濾紙片貼于涂菌平板對應(yīng)位置上。標(biāo)記1 為0.01%氫氧化鈉，標(biāo)記2 為大鯢皮黑色素，標(biāo)記3 為土霉素，標(biāo)記4 為水。每種細(xì)菌重復(fù)3 個抑菌平板。平板在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，測定濾紙片平均抑菌圈直徑，按下列公式計算抑菌力。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢皮色素溶解性質(zhì)分析

大鯢皮黑色素溶解性質(zhì)的結(jié)果見表1。

表1 大鯢皮黑色素在不同溶劑中的溶解性Table 1 Solubility of melanin from gaint salamander skin pigment in different solvents

由表1可以看出，大鯢皮黑色素難溶于有機(jī)溶劑，微溶于水，易溶于偏堿性的極性溶液。這與現(xiàn)已報道的烏雞、烏賊、黑螞蟻、林蛙卵等黑色素的溶解性一致。

2.2 大鯢皮色素的定性結(jié)果分析

2.2.1 大鯢皮色素的紫外（ultraviolet-visible，UV-VIS）光譜

大鯢皮色素的紫外光譜圖見圖1。

圖1 大鯢皮色素的紫外光譜圖Fig.1 Ultraviolet visible spectrum of giant salamander skin pigment

黑色素多聚物因其高度的共軛效應(yīng)而產(chǎn)生廣譜的光吸收特性。由圖1可知大鯢皮黑色素在紫外區(qū)的最大吸收波長為214 nm，在可見光區(qū)沒有特征吸收峰，在200 nm～400 nm 波長范圍內(nèi)吸收值隨波長的增大而減少。這與報道的不同來源動物黑色素的最大吸收波長在210 nm 左右一致。宋茹等[15]用酶解法制備的魷魚黑色素在220 nm 有特征吸收峰。衡惠等[16]用堿溶酸沉法提取的黑螞蟻黑色素的最大吸收峰在212 nm 處。

2.2.2 大鯢皮色素的紅外光譜譜圖

紅外光譜是一種化合物結(jié)構(gòu)鑒定的有效方法。大鯢黑色素的傅里葉紅外結(jié)構(gòu)圖如圖2所示，其與烏雞黑色素紅外圖譜的對比結(jié)果如表2所示。

圖2 大鯢皮色素紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of giant salamander skin pigment

表2 大鯢黑色素和烏雞黑色素峰位的異同Table 2 Similarities and differences of peak location between gaint salamander and black chicken

由圖2可知，大鯢黑色素在1 653 cm-1處的強(qiáng)吸收峰推測其有黑色素典型的苯醌類結(jié)構(gòu)，3 296 cm-1和1 543 cm-1處的吸收峰推測有吲哚結(jié)構(gòu)，617 cm-1推測其可能含硫元素，紅外圖譜顯示大鯢黑色素為具有吲哚結(jié)構(gòu)的含硫異聚物。由表2可知，大鯢黑色素與烏雞黑色素主要特征吸收峰所處位置非常接近，說明大鯢皮黑色素與烏雞黑色素的主要功能基團(tuán)基本一致。

2.3 大鯢皮色素的穩(wěn)定性結(jié)果分析

2.3.1 大鯢皮色素的光穩(wěn)定性分析

鯢皮膚色素的光穩(wěn)定性見表3。

表3 大鯢皮膚色素的光穩(wěn)定性Table 3 Photostability of giant salamander skin pigments

光穩(wěn)定性試驗過程中，隨著試驗天數(shù)的增加，可觀察到光照下的大鯢皮色素溶液顏色略微變淡，而在陰暗處的溶液顏色基本無變化。測量其吸光度值可知，光照處和陰暗處的溶液吸光度逐漸降低，到第21天時，吸光度分別為0.160 和0.165，降低了0.013 和0.008。光照對大鯢皮色素穩(wěn)定性影響較小，表明大鯢皮黑色素有良好的光穩(wěn)定性。

2.3.2 大鯢皮色素的熱穩(wěn)定性

大鯢皮色素的熱穩(wěn)定性見表4。

表4 大鯢皮色素的熱穩(wěn)定性Table 4 Thermal stability of giant salamander skin pigments

熱穩(wěn)定性試驗過程中，隨著溫度不斷升高，大鯢皮色素的溶解度也逐漸增加，表現(xiàn)為紫外吸光值的增加；大鯢皮色素溶液在室溫（28 ℃）～100 ℃保持8 h 后其吸光值基本保持不變。表明大鯢皮色素具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.3.4 大鯢皮色素金屬離子穩(wěn)定性

大鯢皮膚色素金屬離子穩(wěn)定性見表5。

表5 大鯢皮膚色素金屬離子穩(wěn)定性Table 5 Metal ion stability of giant salamander skin pigments

由表5可知，在大鯢皮色素溶液中加入不同金屬離子后，產(chǎn)生不同程度的變化。其中Mg2+，Zn2+在與大鯢皮色素共存的情況下較穩(wěn)定，且顏色沒有發(fā)生變化。FeCl3在水中電離出的Fe3+與大鯢皮色素發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，放置48 h 后，溶液顏色由淡紅色變成深磚紅色，振蕩后靜置有少許不溶物析出，這是由于金屬離子鐵有較強(qiáng)的配位能力，與大鯢皮色素中較活潑的官能團(tuán)形成絡(luò)合，致使其產(chǎn)生變化。鐵離子對大鯢黑色素穩(wěn)定性的影響較大，在貯藏應(yīng)用中應(yīng)避免鐵離子的接觸。蘇玉春等[18]研究了Ca2+、Na+、Zn2+、Mg2+、Al3+和Fe3+等對林蛙卵黑色素穩(wěn)定性的而影響，發(fā)現(xiàn)鐵離子最影響黑色素穩(wěn)定性。

2.4 大鯢皮色素抗氧化結(jié)果

2.4.1 清除超氧陰離子自由基（O2-·）的檢測結(jié)果

超氧陰離子自由基（O2-·）清除率結(jié)果見圖3。

圖3 超氧陰離子自由基（O2-·）清除率Fig.3 O2-·free radical scavenging rate

從圖3可以看出，在試驗設(shè)置的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)大鯢皮色素對超氧自由基均有一定的清除作用，其清除能力與質(zhì)量濃度成正比。當(dāng)濃度在2.5 mg/mL 時，大鯢皮色素對超氧陰離子自由基的清除率為30.51%，而VC對超氧自由基的清除能力較強(qiáng)，在濃度2 mg/mL時清除率就已超過90%。

2.4.2 清除羥基自由基（·OH）的檢測結(jié)果

大鯢皮色素對羥自由基的清除率曲線見圖4。

圖4 大鯢皮色素對羥自由基的清除率曲線Fig.4 Scavenging rate of hydroxyl radicals

從圖4可知，大鯢皮色素在試驗設(shè)置的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對羥自由基的清除作用隨濃度的增大而增強(qiáng)，但清除作用顯然均沒有VC高。在濃度為0.5 mg/mL～2.0 mg/mL 時，隨著濃度的增加，大鯢皮色素對羥自由基的清除率顯著升高，但當(dāng)濃度高于2 mg/mL 時，隨濃度的增加，清除率緩慢增加。濃度在2.5 mg/mL 時，大鯢皮色素對羥基自由基的清除率為54.17%，而VC在濃度1.5 mg/mL 時清除率達(dá)到93%以上。

吳世玉等[19]測定了林蛙卵黑色素的抗氧化性，表明林蛙卵黑色素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對超氧陰離子的IC50為1.250 mg/mL，對羥自由基的IC50為0.662 mg/mL。陳士國等[20]測定了魷魚墨黑色素對羥基自由基與超氧陰離子自由基的清除活性，結(jié)果表明其清除超氧陰離子自由基和羥基自由的IC50分別為0.015 mg/mL 和0.2 mg/mL。動物黑色素抗氧化性大小因動物種類而存在差異，種類不同，其抗氧化活性的高低也不同。

2.4 大鯢皮色素抗紫外性

大鯢皮色素對不同波長紫外光的吸收情況如圖5所示。

圖5 大鯢皮色素對不同波長紫外線的吸收Fig.5 Absorption of ultraviolet of different wavelengths by the giant salamander skin pigments

由圖5可知，大鯢皮黑色素對不同波長的紫外線均有吸收作用，紫外線波長越長，抗紫外作用越弱。在紫外短波區(qū)的200 nm～230 nm 范圍內(nèi)，大鯢皮黑色素吸光值高于二氧化鈦，在中波區(qū)和長波區(qū)，其吸光值介于二氧化鈦和烏賊黑色素之間，說明大鯢皮黑色素對紫外線的吸收主要集中在短波區(qū)。

2.5 大鯢皮色素抗菌性

大鯢皮色素對不同菌種的抑菌圈大小如表6所示。

表6 大鯢皮色素對不同菌種的抑菌圈直徑Table 6 Bacteriostasis circle diameters of giant salamander skin pigments to different strains cm

由表6可以看出，大鯢皮色素對大腸桿菌的抑菌圈和土霉素較接近，說明大鯢皮色素對大腸桿菌有明顯的抑菌作用，抑菌效果為土霉素抑菌效果的75%；大鯢皮色素對銅綠假單胞菌、藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈均為0，說明大鯢皮色素?zé)o抑制銅綠假單胞菌、藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌效果。

Yuspihana F 等[6]研究了墨魚黑色素對大腸桿菌的抑菌力，表明黑色素對大腸桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，其抑菌活性可達(dá)99.99%。這與本文中大鯢皮膚黑色素對大腸桿菌有較強(qiáng)抑菌力的結(jié)果一致，但黑色素對大腸桿菌抑菌力的大小隨動物種類不同而不同。

3 結(jié)論

對大鯢皮黑色素的紫外-可見光譜、紅外光譜進(jìn)行采集，得出大鯢皮色素的紫外最大吸收峰在214 nm，為具吲哚結(jié)構(gòu)的含硫異聚物。大鯢皮色素的光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性良好，受鐵離子影響較大，其可以作為安全、無毒、穩(wěn)定性好的天然色素使用，但在貯藏過程中要避免鐵離子。

大鯢皮膚色素具有一定的保健功能，可將其添加到營養(yǎng)保健品、防曬品、美容護(hù)膚品和藥品中，提升大鯢價值，延長大鯢產(chǎn)業(yè)鏈。