鄧大豪 鄧濤 周游

摘 要 針對(duì)中國(guó)南方磚紅土壤的特點(diǎn)，通過(guò)比較和優(yōu)化土壤微生物總DNA的提取方法，獲得較高質(zhì)量的DNA，從而進(jìn)行土壤細(xì)菌16S rDNA基因擴(kuò)增和真菌ITS rDNA基因擴(kuò)增。結(jié)果表明：方法一提取的土壤微生物DNA受到腐殖質(zhì)等影響無(wú)法進(jìn)行基因擴(kuò)增；方法二提取的DNA可以進(jìn)行土壤微生物基因組16S rDNA基因擴(kuò)增，提取時(shí)間大大減少，但無(wú)法進(jìn)行ITS rDNA基因擴(kuò)增；方法三提取的DNA質(zhì)量最好，可以進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA和真菌ITS rDNA基因組擴(kuò)增。

關(guān)鍵詞 土壤微生物 ；DNA提取 ；16S rDNA ；ITS rDNA

中圖分類號(hào) Q939.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2019.01.010

Abstract According to the characteristics of latosols in southern China， extraction methods for soil microbial total DNA were compared and optimized to produce high quality total DNA s from the soil microbes in latosols， and the soil bacteria were identified by using the 16S rDNA amplification and the soil fungi by using ITS rDNA. The results showed that the soil microbial DNA extracted by the first method could not be amplified by the ITS and 16s primers because of the existence of humus and others. The DNA extracted by the second method could be used to amplify the 16S rDNA gene of soil microbial genome with shorter extraction time， but the ITS rDNA gene amplification could not be performed. The extracted DNA by the third method was best in quality and could be used for bacterial and fungal genome amplification.

Keywords soil microbe ； DNA extraction ； 16S rDNA ； ITS rDNA

土壤是微生物的主要棲息地，但是，99%的微生物都難被純培養(yǎng)。土壤微生物的多樣性研究有利于穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)和維護(hù)生態(tài)平衡。利用宏基因組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，可以獲得土壤微生物多樣性信息，直接從土壤環(huán)境中提取和純化DNA是土壤宏基因組學(xué)技術(shù)的構(gòu)建關(guān)鍵步驟[1]。

“磚紅壤”（Latosols）指富含鐵與鋁氧化物， 出現(xiàn)在地下層呈松軟狀，或者由于其上層物質(zhì)受侵蝕后流失而變?yōu)閳?jiān)硬的紅色覆蓋層。在中國(guó)長(zhǎng)江以南廣大地區(qū)分布著磚紅壤[1]。與其他土壤相比，磚紅壤發(fā)生富鐵鋁化和生物富集過(guò)程，礦化作用強(qiáng)烈，形成腐殖質(zhì)，而腐殖質(zhì)污染會(huì)影響土壤DNA提取與后續(xù)研究。因此，磚紅壤的土壤DNA提取具有重要意義。

直接裂解法和細(xì)胞分離提取法是常用的提取土壤DNA的方法。直接裂解法是破碎土壤中的微生物細(xì)胞而得到DNA的方法；細(xì)胞分離提取法是先從土壤中將微生物細(xì)胞分離出來(lái)后再進(jìn)行裂解以得到DNA的方法。直接裂解法效率較高，所得DNA比細(xì)胞分離提取法更能代表土壤所含微生物的種類，但它對(duì)DNA的剪切力較強(qiáng)，且提取DNA易受土壤中多種PCR的抑制物的污染[2]。細(xì)胞分離提取法主要有物理法、化學(xué)法和酶法3種。物理法的主要措施是振蕩、液氮研磨、研缽研磨、凍融、超聲波等；化學(xué)法的主要化學(xué)試劑是能夠溶解細(xì)胞膜的疏水成分的SDS，CTAB、高鹽、異硫氰酸胍等；酶法常用溶菌酶、蛋白酶K、裂解酶等處理。物理法、化學(xué)法和酶法可以聯(lián)合使用。在前人工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)了解氯化鈣、PVP、焦磷酸鈉、Triton X-100[3]、PVPP[4]、硫酸銨鋁[5]、粉末活性炭（PAC）[6]、無(wú)水乙醇[7]、異丙醇、液氮[8]、纖維素酶、蝸牛酶、溶菌酶[9]、磁珠[10-11]等試劑以及方法的優(yōu)點(diǎn)與缺陷，優(yōu)化土壤微生物總DNA的提取方法。

常用提取土壤DNA方法只適用于擴(kuò)增細(xì)菌基因組，提取土壤DNA進(jìn)行真菌ITS rDNA基因組擴(kuò)增是一個(gè)瓶頸。針對(duì)磚紅壤，加強(qiáng)DNA雜質(zhì)去除這一步，主要是前期預(yù)處理和后期純化，同時(shí)處理好土壤微生物的裂解。本研究的主要目的是比較和優(yōu)化土壤微生物總DNA的提取方法，以解決提取土壤DNA進(jìn)行真菌ITS rDNA基因組擴(kuò)增的瓶頸，為后期研究土壤微生物多樣性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

Biosharp DNA 上樣緩沖液（6×）；Bioteke 2×Power Taq PCR MasterMix；上海領(lǐng)駿生物磁珠（Magnetic beads）；方法一磷酸鈉緩沖液PBS（0.12 mol/L，pH 8.0）；裂解液Ⅰ：0.15 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA，pH 8.0；裂解液Ⅱ ：0.1 mol/L NaCl，0.5 mol/L Tris-HCl pH 8.0，10% SDS；腐殖質(zhì)去除溶液：0.1 mol/L Tris，0.3 mol/L Na2EDTA，0.1 mol/L NaCl 0.292 g，pH 10；方法二DNA提取緩沖液：0.1 mol/L Tris-HCl，1.5 mol/L NaCl，3% CTAB，pH 8.0；0.5mol/L氯化鈣溶液；方法三DNA提取緩沖液：0.1 mol/L Tris，0.1 mol/L EDTA，1.5 mol/L NaCl，2%CTAB，pH 8.0；Bio TEKE 生產(chǎn)的 2× Power Taq PCR MasterMix；細(xì)菌和真菌通用引物27F，1492R，ITS1，ITS4由上海生工合成。

1.1.2 主要儀器

凝膠成像系統(tǒng)，英國(guó)Fire Read公司生產(chǎn)；超純水制備系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司產(chǎn)；VELOCITY 18R 臺(tái)式冷凍離心機(jī)，澳大利亞Dynamica公司生產(chǎn)；雙模塊PCR儀，新加坡Bio-Rad公司產(chǎn)品；電泳儀，中國(guó)北京市六一儀器廠公司生產(chǎn)；電熱恒溫水槽，中國(guó)上海一恒科技有限公司生產(chǎn)；渦旋混合器，Qilinbeier公司生產(chǎn)；超微量紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Nanodrop公司生產(chǎn)。

1.1.3 土樣采集

土樣采自海南儋州市寶島新村、廣西武鳴縣培桂村和廣東樂(lè)昌農(nóng)科所香蕉種植地，取回實(shí)驗(yàn)室后放置在-40℃冰箱。土壤各項(xiàng)指標(biāo)見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 土壤微生物DNA提取

本研究采用3種方法，每種方法提取3種不同土壤樣品DNA。

方法一：參照陳邦等[12]方法，使用凍干機(jī)凍干后并且研磨的土壤提取。

方法二：設(shè)計(jì)使用磁珠提取土壤DNA的方法。 取1 g凍干研磨土樣放入2 mL離心管，加0.3 g玻璃珠和1 mL 15%硫酸銨鋁溶液，在最大速度下勻化2 min，室溫下12 000 r/min離心2 min，然后傾析上清液；加入1 mL腐殖質(zhì)去除溶液，在最大速度下勻化2 min，室溫下12 000 r/min離心2 min，然后傾析上清液；加入氯化鈣溶液，以最大速度勻漿2 min，室溫下12 000 r/min離心2 min，然后傾析上清液；加入DNA提取緩沖液800 μL，以最大速度均質(zhì)5 s，加200 μL SDS，上下混合，并在65℃下孵育20 min，12 000 r/min離心5 min；取上清液，放冷至室溫后，沿管壁加人0.6倍體積異丙醇立即混勻，然后加人 10 μL磁珠溶液渦旋30 s，置于磁力架上磁分離，吸除廢液；依次加人500 μL 70% 乙醇、預(yù)冷的無(wú)水乙醇，室溫晾干后加人50 μL TE洗脫，加入RNAase，37℃下水浴10 min，置于磁力架吸附得到DNA提純液體。

方法三：參照林先貴[13]的方法，使用凍干研磨土并改良提取緩沖液。DNA提取緩沖液：0.1 mol/L Tris，0.1 mol/L EDTA，1.5 mol/L NaCl，2% CTAB，pH 8.0。

1.2.2 土壤微生物總DNA濃度及純度測(cè)定

使用美國(guó)Nanodrop 公司生產(chǎn)的超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.2.3 土壤微生物基因組16S rDNA基因擴(kuò)增和ITS rDNA基因擴(kuò)增

細(xì)菌引物為通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）[13]，1492R（5'-TACGGCTACTTA CGACT

T-3'）。真菌引物為通用引物ITS1（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'），ITS4（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT -3'）。細(xì)菌及真菌PCR擴(kuò)增體系：Taq PCR MasterMix 12.5 μL，引物各1 μL，土壤微生物總DNA 1 μL，加超純水至 25 μL。細(xì)菌PCR擴(kuò)增程序：94℃ 5 min； 94℃ 44 s，57℃退火60 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。真菌PCR擴(kuò)增程序：94℃ 4 min； 94℃ 30 s，58℃退火50 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel處理數(shù)據(jù)，Microsoft PowerPoint制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取土壤DNA的濃度與純度

在土壤樣品提取過(guò)程中，DNA很容易受到重金屬、腐植酸、酚類物質(zhì)等的污染。通常檢測(cè)DNA樣品純度的指標(biāo)有A260/A280和A260/A230比值，其中A260/A280比值主要用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)和酚等物質(zhì)的污染情況，理想比值是1.8，小于1.7時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染，大于2.0時(shí)表明可能有異硫氰酸殘存；A260/A230比值主要用來(lái)檢測(cè)碳水化合物、鹽類或有機(jī)物等雜質(zhì)污染情況，理想比值是2.5，若比值小于2.0，表明樣品被碳水化合物、鹽類或有機(jī)溶劑污染。如表2所示，3種方法提取的DNA均受到不同程度的蛋白質(zhì)、酚、碳水化合物、鹽類或有機(jī)溶劑污染。方法一提取DNA濃度較高；方法二使用時(shí)間最短，提取DNA濃度低；方法三提取DNA濃度最低，因?yàn)榉椒ㄈ^(guò)程處理步驟較多，造成了核酸的損失，純度最高（表2）。

2.2 總DNA質(zhì)量檢測(cè)

土壤微生物 DNA 的電泳檢測(cè)結(jié)果（圖1）可以看出，利用方法一提取到的同種土壤樣本的微生物基因組DNA有條帶，但是不清晰，是受到腐殖質(zhì)等的影響。方法二及三未出現(xiàn)條帶，可能是DNA含量過(guò)低。

2.3 土壤微生物基因組16S rDNA基因擴(kuò)增

從土壤中提取的微生物總DNA中常有腐植酸等的污染，抑制DNA聚合酶的活性，最終導(dǎo)致土壤微生物基因組PCR擴(kuò)增無(wú)法進(jìn)行。土壤微生物16S rDNA基因的擴(kuò)增結(jié)果（圖2）顯示，方法二、三提取到的土壤微生物DNA未經(jīng)進(jìn)一步純化可擴(kuò)增出16S rDNA基因。

2.4 土壤微生物基因組ITS rDNA基因擴(kuò)增

如圖3所示，方法一和方法二均未擴(kuò)增到真菌DNA，方法三提取到的土壤微生物DNA未經(jīng)進(jìn)一步純化可擴(kuò)增出ITS rDNA基因。結(jié)果顯示，土壤微生物基因組ITS rDNA基因擴(kuò)增比16S rDNA基因擴(kuò)增更易受到腐植酸等污染影響。結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，方法三能適用于土壤微生物多樣性的下一步實(shí)驗(yàn)。

2.5 提取方法的穩(wěn)定性與應(yīng)用性

本研究?jī)?yōu)化了方法三預(yù)處理方式與裂解方法。利用方法三提取3個(gè)不同土壤樣品DNA，進(jìn)行細(xì)菌和真菌基因擴(kuò)增，所提DNA均可擴(kuò)增。可知方法三所提取DNA具有一定的穩(wěn)定性與應(yīng)用性。

3 討論

隨著宏基因組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，從土壤中獲得高純度、高得率和完整性好的總DNA 是在基因水平上研究土壤微生物群落多樣性的基礎(chǔ)[14-15]。從土壤中提取微生物總DNA主要有兩步：（1）土壤微生物的裂解；（2）DNA 雜質(zhì)的去除。土壤微生物裂解是為了提取DNA，陸文利等[16]為了提高土壤微生物的提取率，增加了土壤微生物的裂解次數(shù)，但是提取次數(shù)的增加代表大量時(shí)間的增加，本文為了節(jié)約時(shí)間，未采用該方法。

在土壤微生物的裂解這一步，本文3種方法均采用直接裂解法提取DNA，從土壤中直接裂解微生物以獲取總微生物DNA與細(xì)胞分離提取法比較，其優(yōu)勢(shì)在于微生物種類采集較多；其缺點(diǎn)在于這樣得到的DNA含有較多影響后續(xù)研究的腐殖質(zhì)、重金屬離子等[17]。方法一采用溶菌酶、SDS和凍融法；方法二采用CTAB和SDS；方法三結(jié)合CTAB、SDS和溶菌酶裂解土壤微生物。方法三可以進(jìn)行細(xì)菌和真菌基因擴(kuò)增，說(shuō)明將CTAB、SDS和溶菌酶結(jié)合裂解土壤微生物較好。

在DNA雜質(zhì)去除這一步，主要是前期預(yù)處理和后期純化。對(duì)土壤樣品進(jìn)行預(yù)處理，可以達(dá)到去除腐植酸等污染的目的，陳邦等[12]使用磷酸鈉緩沖液PBS洗滌土樣2次；趙勇等[18]在微生物細(xì)胞裂解前采用TENP 緩沖液、PBS緩沖液對(duì)土壤樣品進(jìn)行了2次洗滌；王澍等[19]采用 CaCO3懸浮液對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。后期純化方式有CsCl密度梯度超速離心、層析、膠回收等。同時(shí)在土壤微生物DNA的獲得過(guò)程中，土壤礦物類型、質(zhì)地、有機(jī)質(zhì)含量以及pH值等因素，均會(huì)影響DNA提取效率和質(zhì)量[20-21]。方法一前期預(yù)處理是PBS緩沖液；方法二使用硫酸銨鋁溶液、腐殖質(zhì)去除溶液、氯化鈣溶液3種溶液進(jìn)行預(yù)處理；方法三前期預(yù)處理是進(jìn)行凍干研磨，后期進(jìn)行二次沉淀再純化，可降低腐植酸等的影響。方法三與其他研究明顯差異在前期預(yù)處理采用凍干研磨，凍干研磨是否對(duì)土壤微生物種類多樣性有影響還需進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，方法一提取DNA濃度較高，但是不能直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可能原因?yàn)槭艿礁菜岬鹊挠绊?，方法一有大量腐植酸等的污染，提取時(shí)間長(zhǎng)，方法繁瑣。方法二只能進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，可能原因是ITS rDNA PCR比16S rDNA PCR更易受到腐植酸等污染的影響，方法二提取DNA有輕微污染。綜合來(lái)看，方法三最好，方法三進(jìn)行前期預(yù)處理為凍干研磨；土壤微生物的裂解使用CTAB、SDS和溶菌酶結(jié)合方法；后期純化方法為二次沉淀純化，與其他方法不同，從而加強(qiáng)抑制腐殖質(zhì)、重金屬離子等污染，提高DNA純度，提取DNA可以進(jìn)行土壤微生物基因組16S rDNA基因擴(kuò)增和ITS rDNA基因擴(kuò)增。與本研究以外的方法相比，方法三純度較低，如果進(jìn)一步提高純度，可以采用膠回收或者吸附柱等方法。

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