王錦亮 劉 軍 李 金 羅 培 羅 珍 申婷婷 王 源③*

肝癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，其病死率高居全球第3位[1]。我國是肝癌高發(fā)國家，每年的發(fā)病及死亡人數(shù)占全球肝癌總?cè)藬?shù)的50%以上，嚴(yán)重威脅著我國人民的健康和生命[2]。隨著研究的深入及各項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展，其治療也由傳統(tǒng)的手術(shù)治療逐漸發(fā)展為多樣化治療，包括放化療、射頻消融、介入、靶向治療等，其中靶向治療具有良好的發(fā)展前景[3]。

近年來，隨著靶向超聲造影劑的設(shè)計(jì)及制備，己得到極大的進(jìn)步，靶向超聲微泡造影劑在超聲分子顯像及治療中的研究和應(yīng)用愈來愈受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。靶向超聲造影劑可以作為治療藥物或基因的載體，通過血液循環(huán)特異性地聚集于靶組織，從而達(dá)到靶向治療的目的[4-5]。本研究在造影劑中負(fù)載磁靶向納米粒子并運(yùn)載基因，研制出一種新型的超聲微泡運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)造影劑，既可以在外加磁場(chǎng)的作用下實(shí)現(xiàn)基因的靶向高效定位釋放，又可以利用磁性粒子的磁感應(yīng)升溫特性對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行熱療，為今后實(shí)現(xiàn)該微泡造影劑用于腫瘤的聯(lián)合治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究資料

從美國ATCC公司購買HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)后隨機(jī)分為3組，A組加入1640培養(yǎng)液，B組加入超聲微泡運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)造影劑，C組加入超聲微泡運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)造影劑同時(shí)置于MFH板SP-04C高頻加熱器平板線圈上1 h。

1.2 儀器與試劑

(1)儀器。采用Axios-Metals WDXRF型能譜儀(美國ThermoNoran公司)，SHR/DY-2000型機(jī)械振蕩儀(重慶影像研究所)，SPG-06A高頻磁感應(yīng)加熱設(shè)備(深圳雙平高頻加熱器廠)，XSP-63B型熒光顯微鏡(北京測(cè)維光電儀器廠)，TCS SP8 X型激光共聚焦顯微鏡[徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司]，F(xiàn)ACSVantage SE型流式細(xì)胞儀(美國Becton-Dickson公司)，H43-PMW4015型激光粒度分析儀(英國MALVERN公司)。

(2)試劑。二硬脂酞磷脂酞膽堿(DSPC)、二棕稠酞磷脂酞乙醇胺(DPPE)(美國Sigma公司)；六氟化硫微泡(SF6)氣體(南京特種氣體公司)；人肝癌細(xì)胞系HepG2(廣東廣益生物科技有限公司)；FeCl36H2O、FeCl24H2O、氨水、聚乙烯亞胺(PEI)、吐溫80、甘油、丙二醇、pEGFP-C1(4.7 kb)、Fe3O4磁性納米粒子，PLXSN質(zhì)粒以及Ecoli DH5Q(上海化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)超聲微泡的制備

采用化學(xué)共沉淀法加入100 ml、5∶3(Fe2+∶Fe3+)比例溶液于燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)和磁力攪拌下滴加氨水，溶液中出現(xiàn)黑色沉淀物時(shí)停止滴加氨水，加熱30 min使有機(jī)溶劑蒸發(fā)完全，將葡萄糖和丙二醇按比例配置的水合液加入西林瓶中，超聲分散后使其形成脂質(zhì)懸液。在此懸液中加入20 ml的PEG4000和0.01 ml的吐溫80，后將15 mlDNA/PEI/Fe3O4和明膠按比例加入到脂質(zhì)懸液中，用注射器充入定量的SF6氣體置換西林瓶上方的空氣。將西林瓶放入機(jī)械振蕩器中振蕩60 s，即得運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)超聲微泡。

1.4 運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)超聲微泡外升溫實(shí)驗(yàn)

以PBS溶液配制出Fe3O4濃度分別為1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L及2.5 g/L的4種運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)超聲微泡溶液，各取5 ml入平底試管(20 mm)中，以20 ℃為起始溫度，置于輸出電流30 A、頻率230 kHz的SPG-06A高頻磁感應(yīng)加熱設(shè)備加熱1 h。每5 min測(cè)1次溫度，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、溫度為縱坐標(biāo)繪制磁性脂質(zhì)微泡的升溫曲線[6]。

1.5 檢測(cè)方法

超聲微泡運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)造影劑聯(lián)合磁流體熱療對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖活性影響的檢測(cè)方法為：①3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)方法測(cè)定細(xì)胞增殖率；②流式細(xì)胞儀的測(cè)定。

1.5.1 MTT方法測(cè)定細(xì)胞增殖率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞并吹打成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)整為4×104/ml，按每孔100 ml接種于96孔板，每組5個(gè)接種復(fù)孔，接種細(xì)胞24 h后，隨機(jī)分為3組，給定輸出電流30 A，交變磁場(chǎng)為4 kW，兩板置于飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入MTT20 pl，以相同條件繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)液體，加入溶液150 μl二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)/孔，搖勻l0 min。酶標(biāo)儀讀取在493 nm處的光密度(optical density，OD)值，測(cè)得細(xì)胞增殖率。各組細(xì)胞存活率計(jì)算為公式1[7]：

1.5.2 流式細(xì)胞儀的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌HepG2細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液，將其濃度調(diào)整為3×105/ml后接種于培養(yǎng)瓶。3組共接種3個(gè)培養(yǎng)瓶，分別為A組、B組和C組，24 h后A組加入1640培養(yǎng)液，B組加入超聲微泡運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)造影劑，C組加入超聲微泡運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)造影劑且置于SP-04C高頻加熱器平板線圈上l h，給定交變磁場(chǎng)4 kW，輸出電流30 h，3瓶細(xì)胞置于飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。檢測(cè)前將PBS洗滌2次的細(xì)胞重懸于0.5 ml碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液(20 mg/ml，0.25 mg/m1 RNase A)中于室溫下避光染色30 min，用目絲網(wǎng)過濾后上機(jī)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用均值加減標(biāo)準(zhǔn)差和百分比表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)超聲微泡表征

白光下觀察超聲微泡大小均一，分布均勻。微泡造影劑粒徑(Diameter)為(512.57士25.18)nm，其表面電位(Zeta-potential)為(-2.54士0.75)mV。激光激發(fā)后，周圍呈現(xiàn)綠色熒光，表明靶向載基因微泡成功構(gòu)建，如圖1所示。

圖1 激光共聚焦顯微鏡下微泡成像特征圖(×400)

2.2 運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)超聲微泡體外尋靶

400倍光鏡下觀察到運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)超聲微泡與肝癌HepG2細(xì)胞緊密結(jié)合，主要分布在細(xì)胞周邊及細(xì)胞壁游離面上，如圖2所示。

圖2 超聲微泡運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)造影劑體外尋靶圖(×400)

2.3 運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)超聲微泡外升溫實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在磁場(chǎng)強(qiáng)度恒定條件下，運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)超聲微泡升溫能力與Fe3O4磁性納米粒子濃度呈正相關(guān)，即濃度越高，升溫越快，但有共同規(guī)律。前30 min升溫快速，30～50 min升溫平緩，50 min后恒定于42～62℃[1](如圖3所示)。

圖3 不同濃度Fe3O4超聲微泡運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)造影劑感應(yīng)升溫圖

2.4 肝癌HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)

PEGF-Cl/PEI/Fe3O4磁性脂質(zhì)微泡轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下裸露DNA直接轉(zhuǎn)染效果(如圖4A所示)，超聲微泡運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)造影劑轉(zhuǎn)染效果(如圖4B)見綠色熒光蛋白的表達(dá)，明場(chǎng)圖如圖4C所示。

圖4熒光顯微鏡下肝癌HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)圖(×400)

2.5 增殖活性的影響

超聲微泡運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)造影劑治療聯(lián)合磁流體熱療對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖活性的影響。

2.5.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A組存活率為100%，B組存活率為73.6%，C組存活率為50.5%，B組和C組對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖均有抑制作用，B組與A組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.015，P=0.0451)，C組與A組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=16.281，P＜0.001)，C組對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用顯著高于B組，組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.3，P=0.038)，如圖5所示。

圖5運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)超聲微泡對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞抑制情況柱狀圖

2.5.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

各組肝癌HepG2細(xì)胞經(jīng)處理48 h后，F(xiàn)CM分析顯示：A、B、C三組中在細(xì)胞周期G0期前細(xì)胞周期均被不同程度地阻滯在S期，且出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰。B組(21.23%)和C組(41.47%)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率顯著高于A組(0.31%)，且C組凋亡情況最為顯著，三組組間凋亡情況相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=40.33，P＜0.001)；B組與A組凋亡情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=20.318，P＜0.001)，C組與A組凋亡情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=40.549，P＜0.001)，B組與C組凋亡情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=6.534，P=0.011)，見表1。

表1 運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)造影劑治療聯(lián)合磁流體熱療處理肝癌HepG2細(xì)胞的FCM結(jié)果(%)

3 結(jié)論

隨著超聲微泡的研究進(jìn)步，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注運(yùn)用超聲靶向微泡破壞(ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD)這一技術(shù)[8]。利用超聲輻照破壞微泡時(shí)產(chǎn)生的空化效應(yīng)及聲孔效應(yīng)使內(nèi)皮細(xì)胞間隙擴(kuò)大，細(xì)胞膜產(chǎn)生可逆性的小孔，有利于胞外的物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，在造影劑的表面進(jìn)行修飾或其內(nèi)部進(jìn)行負(fù)載，使其成為藥物和基因的靶向載體，制備出兼具靶向診斷和治療的超聲造影劑成為研究熱點(diǎn)，與傳統(tǒng)方法相比，UTMD具有低免疫原性、低毒性、組織特異性及高可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。超聲微泡用于包裹氣體的殼膜材料主要是多聚物、脂質(zhì)或白蛋白等體內(nèi)可生物降解的高分子，可適當(dāng)配比輔料來對(duì)微泡表面進(jìn)行修飾，或通過調(diào)整殼膜材料高分子比例以便于微泡攜帶更多抗體和多肽等配體[11-12]。

超聲微泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)染主要是通過各種方式，將攜帶有基因的微泡注入生物體內(nèi)，并在靶向組織處以超聲輻照。微泡在超聲作用下會(huì)發(fā)生周期性振動(dòng)，并吸收超聲波的能量，在較大能量下崩塌，并引發(fā)一系列化學(xué)反應(yīng)，最終使基因成功入胞。超聲微泡運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)造影劑，使其表面或內(nèi)部攜載的基因或藥物達(dá)到靶向釋放，從而達(dá)到治療疾病的目的[13]。多數(shù)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[3,14]超聲微泡用于體內(nèi)、體外靶向轉(zhuǎn)染，并在多種疾病的診斷及治療方面展現(xiàn)出極好的優(yōu)勢(shì)。金佳美等[15]研究表明，超聲作用微泡產(chǎn)生的空化效應(yīng)，使其攜載的藥物和基因得到高效利用，達(dá)到良好的靶向治療效果。Lentacker等[16]制作的攜帶質(zhì)粒DNA微泡可明顯提高人肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，明顯抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

基因治療成功的關(guān)鍵是基因的有效轉(zhuǎn)染，安全有效地轉(zhuǎn)染目的基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并穩(wěn)定長(zhǎng)期表達(dá)是當(dāng)前研究的主要目的。Suchal等[17]研究發(fā)現(xiàn)，超聲聯(lián)合微泡造影劑所產(chǎn)生的空化效應(yīng)可提高目的基因的轉(zhuǎn)染效率，空化效應(yīng)是微小氣泡在聲波的作用下會(huì)振動(dòng)，生長(zhǎng)并聚集能量，隨著積聚的能量多少不同而發(fā)生振蕩、膨脹、坍塌、收縮等變化過程[18]。本實(shí)驗(yàn)研究采用SF6氣體作為基因載體產(chǎn)生空化效應(yīng)提高基因的轉(zhuǎn)染效率，其結(jié)果顯示，B、C兩組對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖均有抑制作用，但C組對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制作用更為顯著，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組和C組肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率顯著高于A組，且C組肝癌HepG2細(xì)胞凋亡情況更為顯著，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究創(chuàng)新性地將具有高熱穩(wěn)定性、良好的水溶性和較大的生物相容性的磁性納米粒子引入超聲微泡造影劑，旨在賦予普通微泡磁靶向性的同時(shí)，使微泡對(duì)腫瘤組織兼具基因治療和磁感應(yīng)熱療[19]的特性，也證明超聲微泡運(yùn)載基因磁性脂質(zhì)造影劑聯(lián)合磁感應(yīng)熱療對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖活性抑制作用更為顯著。本實(shí)驗(yàn)交變磁場(chǎng)中含有磁性納米粒的脂質(zhì)微泡懸浮液溫度上升后穩(wěn)定在42～62 ℃之間，該區(qū)間溫度對(duì)腫瘤熱療具有良好效果。

4 結(jié)語

本研究成功制備了可以攜帶目的基因的超聲場(chǎng)及磁場(chǎng)的雙靶向超聲微泡，對(duì)腫瘤進(jìn)行磁感應(yīng)熱療，提高了轉(zhuǎn)染效率，有效的抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，為腫瘤靶向治療提供了新思路。