靖吉強(qiáng) 武世珍 郭洪梅 （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 濰坊 261061 ） 陳國(guó)花 譚清華 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局）

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致水貂肺炎的銅綠假單胞菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

靖吉強(qiáng) 武世珍 郭洪梅*（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 濰坊 261061 ） 陳國(guó)花 譚清華 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局）

本文對(duì)致水貂肺炎的病源菌進(jìn)行了分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，致水貂肺炎的病菌為銅綠假單胞菌；藥敏試驗(yàn)結(jié)果為美羅培南和頭孢他啶為高度敏感藥物。

水貂 肺炎 銅綠假單胞菌 鑒定 藥敏試驗(yàn)

濰坊水貂養(yǎng)殖比較普遍，正處于品種不斷更新、產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展的過(guò)程中。但每年的8~9月份，水貂肺炎在不少水貂養(yǎng)殖場(chǎng)頻繁發(fā)生，發(fā)病率有時(shí)高達(dá)60%~80%，致死率高。2018年9月，濰坊一水貂養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生傳染性肺炎，現(xiàn)把病情診斷及病原分離鑒定情況匯報(bào)如下：

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)病水貂，來(lái)自濰坊某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)。沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、Baird-parker培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)自北京路橋技術(shù)股份有限公司。沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)自濰坊天衡醫(yī)療器械有限公司。藥敏紙片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水貂飼養(yǎng)管理和發(fā)病情況調(diào)查 發(fā)生肺炎的水貂場(chǎng)，飼養(yǎng)水貂2000只。平時(shí)飼喂魚(yú)排、雞架、毛蛋、花生粕、玉米面以及含多種微量元素和維生素的預(yù)混劑等構(gòu)成的混合飼料。魚(yú)排、雞架、毛蛋等飼料蒸熟、攪碎后成糊狀飼喂，自由飲水。幼貂斷奶后免疫犬瘟熱活疫苗，初免1個(gè)月后加強(qiáng)免疫一次。在7月初對(duì)非種用幼齡水貂埋植褪黑激素。2018年9月，水貂陸續(xù)發(fā)病，病貂有的呼吸困難，口鼻出血，急性死亡。有的發(fā)育遲緩，不愿運(yùn)動(dòng)，逐漸消瘦。發(fā)病期間投喂復(fù)方新諾明、氨芐西林，效果不明顯。發(fā)病后1周，共死亡當(dāng)年幼貂89只，未埋植褪黑激素的幼齡種貂發(fā)病很少。

1.2.2 病理變化檢查 剖檢剛死亡的水貂2只，可見(jiàn)肺部腫脹，嚴(yán)重出血、淤血。心、脾、肝和腎未見(jiàn)明顯病變。胃、腸內(nèi)容物空虛。

1.2.3 犬瘟熱檢查 按照林特睿檢TM犬瘟熱抗原快速診斷試紙的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，取2只病貂眼、鼻、口的分泌物，和試劑盒的緩沖液混勻，然后取4滴緩沖液加入試紙卡的加樣窗中，5~10min內(nèi)讀取結(jié)果。

1.2.4 觸片、染色、鏡檢 常規(guī)無(wú)菌操作采集2只病貂的肺臟，作觸片。然后用美蘭染色液染色、顯微鏡油鏡檢查。

1.2.5 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 常規(guī)無(wú)菌操作采集2只病貂肺臟，分別接種沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、Baird-parker培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24h，觀(guān)察結(jié)果。

1.2.6 16S rRNA基因序列測(cè)定與比對(duì) （1）分離菌基因組DNA提?。喝⊙涵傊囵B(yǎng)基上生長(zhǎng)出的具有完全溶血性的小菌落，接種營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，獲得純培養(yǎng)物。用該純培養(yǎng)物提取該細(xì)菌的總DNA。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的介紹的操作步驟提取細(xì)菌DNA。提取的總DNA用于分離菌的PCR檢測(cè)。（2）分離菌16S rRNA基因PCR檢測(cè)及測(cè)序：引物采用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物，27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3'；1541R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段為1514bp。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板1μl，2×Master Mix 20μl，上、下游引物個(gè)1μl，加超純水至反應(yīng)體積為40μl，震蕩混勻后，1000轉(zhuǎn)離心1min后放入PCR儀。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min。反應(yīng)結(jié)束，溫度降至4℃，直至取出。取5μl PCR產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳。若有預(yù)計(jì)大小的核酸片段出現(xiàn)，則將剩余的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的PCR產(chǎn)物序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中，用BLAST程序在線(xiàn)進(jìn)行基因序列相似性比對(duì)，搜索與PCR產(chǎn)物序列相同或相似的基因序列。

1.2.7 分離菌的生化試驗(yàn) 將分離菌的純培養(yǎng)物用革蘭氏陰性菌鑒定卡(梅里埃VITEK 2GN 21341)進(jìn)行生化鑒定。嚴(yán)格按該產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)介紹的操作步驟在全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(型號(hào)：VITEK 2 compact system)上進(jìn)行生化試驗(yàn)。

1.2.8 分離菌的藥物敏感性試驗(yàn) 無(wú)菌操作將分離菌的純培養(yǎng)物均勻涂布到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，然后貼藥敏片。37℃培養(yǎng)18~24h。觀(guān)察并記錄結(jié)果。根據(jù)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)/美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)藥敏試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥物敏感性的判斷。

3 結(jié)果

3.1 鏡檢及分離培養(yǎng)的結(jié)果

2只病貂肺臟觸片，染色后鏡檢，均發(fā)現(xiàn)的散在排列的小桿菌。2只病貂的肺臟分別接種沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基等6種培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24h后觀(guān)察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)：Baird-parker培養(yǎng)基未見(jiàn)任何細(xì)菌生長(zhǎng)；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基有很多中等大菌落生長(zhǎng)，菌落周?chē)囵B(yǎng)基被染成藍(lán)綠色；血液瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出大小一致、表面光滑、有β溶血的小菌落；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng)有很多非紅色菌落；沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基有很多微紅菌落生長(zhǎng)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基有很多白綠色小菌落生長(zhǎng)。

3.2 犬瘟熱檢查的結(jié)果

2只病貂犬瘟熱檢查結(jié)果：對(duì)照線(xiàn)?均顯色，而檢測(cè)線(xiàn)(T)均不顯色。因此病貂未患犬瘟熱。

3.3 16S rRNA基因序列測(cè)定與比對(duì)

通過(guò)對(duì)分離菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出約1500bp的核酸片段。將分離菌的16SrRNA基因的序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫(kù)中，用BLAST程序在線(xiàn)進(jìn)行基因序列相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該分離菌與登錄號(hào)為 KR349493.1的序列同源性為99%，因此確定該菌為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)。

3.4 分離菌的生化結(jié)果

分離菌的生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。該生化結(jié)果以98%的概率和極好的鑒定置信度鑒定該菌為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)。

表1 分離菌的生化試驗(yàn)結(jié)果

3.5 藥物敏感性

頭孢他啶、美羅培南敏感。阿莫西林、頭孢呋辛、四環(huán)素、慶大霉素和恩諾沙星等不敏感。具體見(jiàn)表2。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：R為耐藥，S為敏感，I為中介

4 討論

（1）銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)在自然界分布廣泛，可存在于水、土壤和空氣中，是一種常見(jiàn)的條件性致病菌，革蘭氏染色后呈紅色[1]。它可感染狐貍、水貂、雞、犬、牛等多種動(dòng)物，導(dǎo)致被感染動(dòng)物乳房炎、流產(chǎn)、陰道炎、子宮內(nèi)膜炎、肺炎、敗血癥等[2]。這次從發(fā)生肺炎的水貂肺臟中只分離到銅綠假單胞菌，未檢測(cè)到犬瘟熱病毒。說(shuō)明銅綠假單胞菌是導(dǎo)致本次水貂肺炎的致病菌。（2）銅綠假單胞菌可感染不同品種、不同日齡的水貂，可經(jīng)污染的空氣經(jīng)呼吸道感染，也可經(jīng)傷口感染，造成局部化膿，甚至敗血癥。死亡率可達(dá)30%~60%。本次水貂肺炎疫情發(fā)生后，先后波及相鄰的2個(gè)水貂養(yǎng)殖場(chǎng)，造成較大經(jīng)濟(jì)損失。因此，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，定期清糞，嚴(yán)格消毒飼養(yǎng)場(chǎng)所，經(jīng)常滅蠅除蚊，執(zhí)行嚴(yán)格的生物安全措施可減少本病的發(fā)生。（3）對(duì)于經(jīng)常發(fā)生銅綠假單胞菌感染，造成肺炎的水貂場(chǎng)?？煞蛛x銅綠假單胞菌，做成自家苗，在每年的7月初可免疫一次，幼齡水貂個(gè)半個(gè)月后可強(qiáng)化免疫一次，增加免疫效果。通過(guò)免疫接種，降低水貂對(duì)該病的易感性，從而減少該病的發(fā)生[3]。（4）水貂養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)注意廠(chǎng)址的選擇。建場(chǎng)時(shí)應(yīng)遠(yuǎn)離村莊和其他毛皮動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)，以利于防疫。每年的8~9月份，可使用風(fēng)機(jī)濕簾等降溫設(shè)施，使水貂生活在溫度適宜的環(huán)境里，避免熱應(yīng)激導(dǎo)致水貂抗病力下降，減少銅綠假單胞菌導(dǎo)致的水貂肺炎。（5）本次從水貂肺部分離到的銅綠假單胞菌，對(duì)頭孢呋辛、四環(huán)素、慶大霉素等多種抗菌藥不敏感，只對(duì)美羅培南等少數(shù)抗菌藥敏感。為減少銅綠假單胞菌的耐藥性，應(yīng)提升養(yǎng)殖模式，創(chuàng)造更好的養(yǎng)殖環(huán)境，采用優(yōu)質(zhì)飼料，提高水貂抗病力，減少抗菌藥物在水貂養(yǎng)殖過(guò)程的使用。

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濰坊市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)2014GX069，項(xiàng)目名稱(chēng)：山東部分地區(qū)毛皮動(dòng)物肺炎流行病學(xué)調(diào)查及防治技術(shù)研究

（2019–01–10）

S852.61

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1007-1733(2019)04-0009-02